[发明专利]一种分离提纯蛋清溶菌酶的方法

说明书

本发明公开了一种用阳离子交换法结合超滤技术分离提纯蛋清溶菌酶的方法，其包括如下步骤：(1)蛋清预处理：蛋清搅拌后过筛网过滤；(2)树脂预处理；(3)吸附：调节蛋清滤液pH值后加入预处理后的树脂，搅拌后静置吸附；(3)洗脱：用NaCl溶液搅拌洗脱，滤出洗脱液，重复洗脱并合并洗脱液；(4)超滤：将洗脱液用超滤离心管超滤除蛋白、脱盐，得到超滤液；(5)干燥：将超滤液干燥后，即得到所述溶菌酶。所得溶菌酶经过SDS‑PAGE电泳测得纯度高达96％，比活力大于20000U/mg。本发明工艺简单，成本较低，制备获得的溶菌酶纯度高、活性高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种分离提纯溶菌酶的方法。

背景技术

陈艳等人于《生物学杂志》2009年第26卷第2期发表的“溶菌酶的研究进展”中提到溶菌酶是一种碱性蛋白质，广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内，但在蛋清中的含量最丰富(约占蛋清的3.5％)。它能选择性地水解肽聚糖中-1，4糖苷键，同时不破坏其它组织，且本身无毒无害，因而是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可应用于食品、医药和日化等行业的防腐。

目前，溶菌酶的制备方法主要有结晶法、离子交换法、超滤法、聚电解质沉淀法、亲和层析法等。陶凤云等人于《北京联合大学学报(自然科学版)》2006年第20卷第3期发表的“溶菌酶结晶的研究进展”中提到了以NaCl为沉淀剂，MgCl2溶液为洗脱液，醋酸钠溶液为缓冲液的静态膜结晶法。使用该方法操作简单但生产周期长，原料利用率低，不适合工业化生产。

王炜军等人于《华南农业大学学报》1996年03期发表的“脱氨再生几丁质凝胶亲和柱层析法纯化溶菌酶”一文中首次采取脱氨再生几丁质凝胶，用新柱层析法提取纯化溶菌酶。充分体现亲和层析法可快速的实现目的物与其他杂质的分离的优点，但该方法放大困难，回收率低，在粘度大时更易造成层析柱的堵塞，故不适合工业化生产。

余海芬等人于《中国家禽》2008年24期发表的“阳离子交换法提取蛋清溶菌酶的研究”中用阳离子交换树脂法提取蛋清溶菌酶，采用的硫酸铵洗脱液成本较高，制备的溶菌酶的酶纯度和酶比活力不够高。

以上表明国内对溶菌酶的分离纯化、提取制备方法曾经用到结晶法、离子交换层析法、亲和层析法等，但都有一定弊端。即便是目前工业生产主要采用阳离子交换法，通过阳离子树脂吸附、高盐洗脱、脱盐脱水和雾化干燥等步骤获得溶菌酶，但由于溶菌酶洗脱液溶液量大、含盐量高，常用超滤设备负担重、超滤膜因长时间工作易受污染，膜的使用寿命受到很大的影响；上述技术所选择的分离提纯方法、洗脱液、超滤离心时机等条件不适宜，造成分离提纯的成本高，分离后的溶菌酶纯度不高，提取工艺落后使得酶活损失大等问题。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种用阳离子交换法结合超滤技术分离提纯蛋清溶菌酶的方法。提供一种比活力达20000U/mg，纯度高达96％的溶菌酶。本发明工艺简单，无需复杂设备，可以获得高纯度与高生物活性的溶菌酶，克服现有溶菌酶制备工艺的缺点，可大批量生产。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种阳离子交换法结合超滤技术分离提纯蛋白溶菌酶的方法，包括如下步骤：

(1)蛋清预处理：将蛋清搅拌均匀后，过80～120目滤网得蛋清滤液；

(2)树脂预处理：取树脂用蒸馏水洗涤至无明显杂质并滤干，先用盐酸溶液浸泡后，再用蒸馏水冲洗得树脂A；树脂A在氢氧化钠溶液浸泡后，用蒸馏水冲洗得树脂B；其中，树脂选自724大孔弱酸性阳离子交换树脂、732型阳离子交换树脂、D152大孔弱酸性阳离子交换树脂中的一种；

(3)吸附：往蛋清滤液中加入步骤(2)所得树脂B，搅拌混匀后静置吸附，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，得树脂L；