[发明专利]一种高效的基因工程载体

权利要求书

1.一种核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：

5’H-T-F-GOI-3’H；

5’H-T-GOI-F-3’H；

5’H-F-T-GOI-3’H；

5’H-F-GOI-T-3’H；

5’H-GOI-T-F-3’H；

5’H-GOI-F-T-3’H；

5’H-F-GOI-3’H；

5’H-GOI-F-3’H；

其中，

T是外源性终止子；

F为B-C-Marker-B所示基因片段；其中B是位点特异性重组位点；C是所述位点特异性重组位点相对应的重组酶表达盒；Marker是标记基因表达盒；

GOI是外源基因表达盒；

或者，

所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构：

5’H-F-GOI-P-3’H；

5’H-GOI-F-P-3’H；

5’H-P-F-GOI-3’H；

5’H-P-GOI-F-3’H；

5’H-F-P-GOI-3’H；

5’H-GOI-P-F-3’H；

5’H-F-GOI-3’H；

5’H-GOI-F-3’H；

其中，

P是外源性启动子；

F、B、C、Marker和GOI如上所述。

2.如权利要求1所述的核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：

5’H-T-F-GOI-3’H；

5’H-T-GOI-F-3’H；

5’H-F-T-GOI-3’H；

5’H-F-GOI-T-3’H；

5’H-GOI-T-F-3’H；

5’H-GOI-F-T-3’H；

其中，T、F、GOI如权利要求1所述；

或者，

所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构

5’H-F-GOI-P-3’H；

5’H-GOI-F-P-3’H；

5’H-P-F-GOI-3’H；

5’H-P-GOI-F-3’H；

5’H-F-P-GOI-3’H；

5’H-GOI-P-F-3’H；

其中，P、F和GOI如权利要求1所述。

3.如权利要求1或2所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述转录终止子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、CYC1和TIF51A等转录终止子，毕赤酵母的ALG6、AOD、AOX1、ARG4、PMA1和TEF1等转录终止子；

转录启动子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、GAP、PGK1和TEF1等转录启动子，毕赤酵母的GAP、ILV5、PGK1、TEF1等转录启动子，诱导启动子AOX1和FLD1等；

所述位点特异性重组位点以及相应的重组酶构成位点特异性重组系统，包括但不限于酿酒酵母的Flp-FRT，细菌噬菌体P1的Cre-loxP和Xygosaccharomyces rouxii的R-RS；

标记基因包括一个或多个抗生素耐受性基因，优选耐受博莱霉素(zeocin)的Shble基因，和耐受卡那霉素(kanamycin，kan)或遗传霉素(geneticin，G418)的neo基因，耐受杀稻瘟菌素(Blasticidin)的BSD基因等。

4.如权利要求1或2所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述重组酶包括但不限于Flp重组酶或Cre重组酶；优选Flp重组酶。

5.如权利要求1或2所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述核苷酸构建物在5’端和3’端还包含同源臂。

6.如权利要求1-5中任一项所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述核苷酸构建物还可以包含当所述核苷酸构建物形成环状时，能够在宿主细胞(例如，细菌)中复制所需的其它基因X，优选细菌复制起点和抗生素耐受性基因；并且当所述核苷酸构建物形成线形构建物时，所述其它基因X的位置在所述核苷酸构建物的B之间的任何位置。