[发明专利]一种高效的基因工程载体

说明书

本发明提供5’到3’分别为T‑F‑GOI；T‑GOI‑F；F‑T‑GOI；F‑GOI‑T；GOI‑T‑F；GOI‑F‑T；F‑GOI；GOI‑F；或P‑F‑GOI；P‑GOI‑F；F‑P‑GOI；F‑GOI‑P；GOI‑P‑F；GOI‑F‑P；F‑GOI；GOI‑F所示核苷酸构建物，各元件如说明书所述。利用该核苷酸构建物可将大量外源基因整合在基因组中，但不破坏整合位点附近的基因功能，不影响宿主细胞的生存。

技术领域

本发明涉及生物技术领域；具体地说，本发明涉及通过两次重组而将大量外源基因整合在生物机体的基因组中，同时避免破坏宿主细胞基因功能的新型基因工程载体。

背景技术

N-糖基化是蛋白翻译后的一个重要修饰过程，对蛋白的结构和功能起着重要的作用。哺乳动物细胞和酵母细胞在内质网腔合成新生肽链的同时，对新生肽链进行相同的N-糖基化起始步骤及修饰加工过程，首先前体寡糖G1c₃Man₉GlcNAc₂被连接到新生肽链Asn-X-Thr/Ser(X为除Pro外的任意氨基酸)保守序列中的Asn残基上，然后在葡萄糖苷水解酶I、Ⅱ和甘露糖苷水解酶I等糖苷水解酶的作用下，蛋白的糖链被加工形成Man₈GlcNAc₂糖链结构，随后带有该糖链的蛋白被转运至高尔基体中。但是在哺乳动物细胞和酵母高尔基体内，蛋白糖链的进一步修饰加工过程则完全不同。在哺乳动物细胞高尔基体内，蛋白上的Man₈GlcNAc₂糖链首先在甘露糖苷水解酶I(MnsI)的作用下，去除三个甘露糖，形成Man₅GlcNAc₂糖链结构；然后在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)的作用下添加一个N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖链结构；然后在甘露糖苷水解酶II(MnsII)的作用下，再去除两个甘露糖，形成GlcNAcMan₃GlcNAc₂糖链结构；接着在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)的作用下再添加一个N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖链结构；最后在半乳糖转移酶(GalT)和唾液酸转移酶(ST)的作用下，加工形成Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和Sia₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂复杂型糖链结构。但是在酵母细胞高尔基体内，在OCH1基因编码的α-l,6-甘露糖转移酶(Ochlp)的作用下,蛋白上的Man₈GlcNAc₂糖链首先接受一个α-l,6-甘露糖，形成Man₉GlcNAc₂糖链结构，然后在其它各种甘露糖转移酶的作用下继续添加甘露糖，形成高甘露糖型的糖链结构。因此，用酵母生产蛋白的一个主要缺陷是对蛋白N-糖基化修饰形成与人体不同的高甘露糖链，它可能改变糖蛋白的结构，影响其功能，具有免疫原性(Kornfeld,R.&Kornfeld,S.Assembly ofasparagine-linked oligosaccharides.Annu.Rev.Biochem.54,631–664,1985)。