[发明专利]抗PD－L1单克隆抗体及其应用

说明书

本发明涉及一种新的抗PD‑L1单克隆抗体以及该抗体的可变区序列，属于生物技术领域。本发明利用重组人PD‑L1蛋白(rhEPD‑L1)作为免疫原，免疫BAL b/c小鼠取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞sp2/0‑Ag14融合，获得了可表达抗PD‑L1抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株能够稳定分泌单一的单克隆抗体。本发明同时克隆了抗PD‑L1单克隆抗体的H链、L链可变区核苷酸及氨基酸序列。本发明的抗PD‑L1单克隆抗体可与PD‑L1特异性结合，阻断PD1与PD‑L1的结合，恢复T细胞的功能。可作为免疫检查点抑制剂，用于癌症及感染性疾病的治疗。

技术领域：

本发明涉及一种能特异性结合PD-L1的单克隆抗体，属于生物技术领域。具体涉及所述单克隆抗体的制备方法，其可变区序列及其应用。

背景技术：

杂交瘤技术(hybridoma technique)，又称单克隆抗体技术，1975年Koehler和Milstein证明，将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞进行融合，可形成针对某一抗原的特异性强的单克隆抗体。杂交瘤技术利用了骨髓瘤细胞能在体外连续传代和淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的特性，将两种细胞进行融合，则成功融合的细胞可具有这两种细胞的主要特性。

PD-1/PD-L1免疫疗法是通过阻断二者间的相互作用来提高免疫应答，具有治疗多种类型肿瘤及感染性疾病的潜力。程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是CD28超家族成员，为一种重要的免疫抑制分子，主要表达在激活的T细胞和B细胞上。PD-1的配体PD-Ls(programmed death-1 ligands)，主要是PD-L1(B7-H1/CD274)和PD-L2(B7-DC/CD273)，其中，PD-L1是PD-1的主要配体。在机体的肿瘤微环境中，肿瘤细胞会高表达PD-L1分子，与T细胞上的PD-1发生结合后，能够抑制T细胞的增殖、活化和相关细胞因子的分泌，抑制T细胞的功能，无法有效激活免疫系统，引起肿瘤细胞的免疫逃逸，增加其转移性和侵犯性。在慢性感染性疾病中(包括乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等)，在慢性感染中也会发生此效应，在感染期间由于高水平抗原刺激，常会出现T细胞耗竭的情况。而针对PD-1、PD-L1的单克隆抗体可以阻断PD-1和PD-L1的结合，使T细胞恢复活力，从而增强免疫应答。目前，多株抗PD-1和PD-L1的抗体已上市，用于多种肿瘤及感染的治疗，如Nivolumab(抗PD-1抗体)、Keytruda(抗PD-L1抗体)等。

本发明以重组人PD-L1胞外区(rhEPD-L1)蛋白为抗原，通过杂交瘤技术筛选制备得到高亲和力的抗PD-L1特异性单克隆抗体，并通过体内外实验验证其高效生物学活性。

发明内容

发明目的

本发明目的之一在于提供一种抗PD-L1单克隆抗体制备方法；

本发明目的之二在于提供一种抗PD-L1单克隆抗体；

本发明目的之三在于提供抗PD-L1单克隆抗体的可变区氨基酸序列及核酸序列。

技术方案

本发明以实验室前期制备得到的重组人PD-L1蛋白作为免疫原，免疫Bal b/c小鼠，待其血清效价达到融合要求，取其脾细胞与sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过HAT选择性培养基筛选得到能稳定分泌抗PD-L1抗体的杂交瘤细胞株，经亚克隆化及扩大培养后，在分子水平上进行抗体重、轻链可变区基因的调取；单克隆抗体可通过将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，取腹水收集后经Protein A/G亲和层析柱纯化获得。

有益效果

本发明成功制备了抗PD-L1单克隆抗体，该抗体特异性好，结合率高，能阻断PD-1与PD-L1生物结合。在体外能有效恢复淋巴细胞活性，促进人外周血淋巴细胞(PBMC)分泌IFN-γ和IL-2，并在体内实验中显示了该单克隆抗体对荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。体内外实验显示，该抗PD-L1单克隆抗体是肿瘤免疫治疗的潜在药物。