[发明专利]一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法

权利要求书

1.一种用于基因组步移的步移引物，其特征在于，包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套所述步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、NSPx-T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。

2.根据权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物，其特征在于，在所述NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。

3.根据权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物，其特征在于，NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQID NO.9所示。

4.一种使用权利要求1所述的用于基因组步移的步移引物的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一轮PCR反应：与待测DNA已知序列互补的SP1和步移引物NSP1对待测DNA模板进行PCR反应；

第二轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP2和步移引物NSP2为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR反应，所述SP2位于SP1的5’端至3’端的内侧；

第三轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP3和步移引物NSP3为扩增引物，以第二轮PCR的产物为模板进行PCR反应，所述SP3位于SP2的5’端至3’端的内侧。

5.根据权利要求4所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，在所述NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。

6.根据权利要求4所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：

1×LA PCR buffer II的Mg²⁺plus；

0.4mM dNTP；

0.2μM SP1；

0.2μM NSPx-P；

基因组DNA，微生物10-100ng或动植物100-1000ng；

2.5U TaKaRa LA Taq HS；

适量ddH₂O。

7.根据权利要求4或5或6所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第一轮PCR反应的扩增程序为：进行5个温度为65℃的PCR反应后，以25℃为退火温度进行1个PCR反应，再进行30个温度为65℃的PCR反应。

8.根据权利要求7所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第二轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：

1×LA PCR buffer II的Mg²⁺plus；

0.4mM dNTP；

0.2μM SP2；

0.2μM NSPx-S；

1μL第一轮PCR反应的DNA模板；

2.5U TaKaRa LA Taq HS；

适量ddH₂O。

9.根据权利要求8所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第二轮PCR反应的扩增程序为：以65℃的高退火温度进行5个循环的PCR反应后，以50℃的中退火温度进行1个循环PCR反应，再以65℃的高退火温度进行30个循环的PCR反应。

10.根据权利要求7所述的用于基因组步移的PCR方法，其特征在于，所述第三轮PCR反应的反应体系总量为50μL，具体包括如下浓度的各组分：

1×LA PCR buffer II的Mg²⁺plus；

0.4mM dNTP；

0.2μM SP3；

0.2μM NSPx-T；

1μL第二轮PCR反应的DNA模板；

2.5U TaKaRa LA Taq HS；

适量ddH₂O。