[发明专利]一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法

说明书

本发明提供一种用于基因组步移的步移引物及其应用的PCR方法，其中步移引物包括用于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套所述步移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx‑P、NSPx‑S、NSPx‑T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全相同，5’端的13个碱基序列完全不同。本发明涉及的PCR方法能够根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列，具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。

技术领域

本发明涉及PCR步移技术领域，具体涉及一种用于基因组步移的步移引物 及其应用的PCR方法。

背景技术

基因组步移技术(Genome Walking)是一种重要的分子生物学研究技术，使用 这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以 下几方面的应用：

1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控 基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行 研究；

2.查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；

3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所 导致的外源基因的插入位点等；

4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；

5.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

对于基因组测序已经完成的少数物种(如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等) 来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大 多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧 的DNA序列，只能采用染色体步移技术。

以PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异 性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向PCR法、连接接 头法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供一种用于基因组步移的步移引物及其应用的 PCR方法，能够根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列。该方法具 有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。

根据第一方面，一种实施例中提供一种用于基因组步移的步移引物，包括用 于基因组步移PCR反应的三套步移引物，分别为NSP1、NSP2、NSP3，每套步 移引物包括分别用于三轮PCR反应的3条引物，分别为NSPx-P、NSPx-S、 NSPx-T，x＝1、2、3，其长度均为25nt，同一套步移引物3’端的12个碱基完全 相同，5’端的13个碱基序列完全不同。

进一步地，在NSP1、NSP2和NSP3中，其G－C含量均为45-55％，Tm值 为：Tm＝4℃(G+C)+2℃(A+T)。

进一步地，NSP1-P、NSP1-S、NSP1-T、NSP2-P、NSP2-S、NSP2-T、NSP3-P、 NSP3-S、NSP3-T的序列依次如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.9所示。

根据第二方面，本实施例还提供一种使用上述的用于基因组步移的步移引物 的PCR方法，包括以下步骤：

第一轮PCR反应：与待测DNA已知序列互补的SP1和步移引物NSP1对待 测DNA模板进行PCR反应；

第二轮PCR反应：以与待测DNA已知序列互补的SP2和步移引物NSP2为 扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR反应，SP2位于SP1的5’端至 3’端的内侧；