[发明专利]一种制备雄性不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物有效
| 申请号： | 201810111390.8 | 申请日： | 2018-02-05 |
| 公开（公告）号： | CN110117613B | 公开（公告）日： | 2022-10-11 |
| 发明（设计）人： | 黄勇平;徐霞;何琳;李恺;张忠杰;陈旭 | 申请（专利权）人： | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;A01K67/033 |
| 代理公司： | 上海恒慧知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 31317 | 代理人： | 张宁展 |
| 地址： | 200032 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 制备 雄性不育 鳞翅目 昆虫 方法 及其 核酸 构建 | ||
1.一种制备雄性不育的鳞翅目昆虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建Ser2基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Ser2基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Ser2基因靶点和polyA；
2)将步骤1)所述的Ser2基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代；和
3)将步骤2)所述的G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配，获得G2代，即得雄性不育的鳞翅目昆虫，所述的鳞翅目昆虫是家蚕。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的第一Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所述的第二Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的Ser2基因敲除核酸构建物还包括第一筛选标记基因表达盒。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述的第一筛选标记基因是红色荧光蛋白基因。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫含有Cas9基因表达盒，所述的Cas9基因表达盒包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：Nos启动子，Cas9蛋白编码序列和SV40终止子。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述的表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫还包括第二筛选标记基因表达盒。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述的共转是将所述Ser2基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒混合后所得的混合液显微注射新鲜昆虫卵。
8.一种Ser2基因敲除核酸构建物，其特征在于，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Ser2基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Ser2基因靶点和polyA；所述的第一Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的第二Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
9.一种防治鳞翅目害虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的方法制备而得的雄性不育的鳞翅目昆虫野外放生，通过与野生鳞翅目昆虫交配，使后代减少，降低种群数量。
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