[发明专利]一种制备雄性不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物

说明书

一种制备雄性不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物。方法包括：构建Ser2基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Ser2基因靶点和polyA；U6启动子，第二Ser2基因靶点和polyA；将所述构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，得G0代，自交得G1代；和将G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配得G2代，即得。本发明利用基于PiggyBac转座子的CRISPR/Cas9技术成功构建了在不影响正常交配行为的前提下雄性不育的鳞翅目昆虫，在鳞翅目害虫通过雄性不育技术进行防治方面具有重要的价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备雄性不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物。

背景技术

家蚕是一种典型的模式经济昆虫，是以桑叶为食料、吐丝结茧的经济昆虫之一。利用家蚕作为昆虫害虫防治特别是鳞翅目害虫的遗传防治的研究对象，将在农林业害虫遗传防治方面产生重大的影响，而且还将在鳞翅目其他昆虫中推广应用。现阶段害虫的生物学防治不育技术大多是使用辐射及四环素诱导，而这两种不育技术耗时耗力并不能有稳定的遗传效应品系，而且大多是释放不育雄虫来进行害虫防治，但是这些不育雄虫相对于野生雄虫来说，其竞争力较弱，不能进行有效交配。在自然界中，雌性成虫在交配过程中大多数运动力较低，通过释放性信息素来吸引雄虫来交配。因此，研究一种稳定遗传并可以通过释放性信息的雌虫以及下一代雄性的有效不育品系迫在眉睫。

雄性不育一直是害虫防治的研究热点，在上世纪50年代早期，美国利用辐射不育技术在人类历史上首次成功地消灭了螺旋锥蝇(Cochliomyia hominivorax)，在1975年2月，日本通过释放通过辐射处理的不育瓜实蝇(Bactrocera cucuribitae)使其根绝成功。通过利用四环素调控雌性的剪接因子，可以使雌性特异性致死。虽然辐射和四环素都能诱导不育昆虫，但是两者的靶标不育虫是雌性，不能是雄性。

在昆虫交配生殖过程中，雄性精液蛋白通过射精行为转移到雌体内，该雄性精液蛋白对雄性和雌性的生殖成功是必不可少的。雄性精液蛋白能够影响雄性精子竞争的成功和雌性的生殖力、生育力、寿命及后代存活率等。据研究报道，雄性副性腺蛋白在生殖交配过程中的分泌是可塑的，可在自然选择下快速进化，且比迄今被认为的更复杂。

发明内容

本发明的目的是鳞翅目昆虫遗传不育技术中缺乏雄性不育的鳞翅目昆虫品系的不足，提供一种制备雄性不育的鳞翅目昆虫的方法及其核酸构建物。

为此，本发明提供一种制备雄性不育的鳞翅目昆虫的方法，其包括以下步骤：

1)构建Ser2基因敲除核酸构建物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：第一sgRNA表达元件和第二sgRNA表达元件；所述的第一sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第一Ser2基因靶点和polyA；所述的第二sgRNA表达元件包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：U6启动子，第二Ser2基因靶点和polyA；

2)将步骤1)所述的Ser2基因敲除核酸构建物和可表达Piggybac转座酶的PHA3PIG质粒共转鳞翅目新鲜昆虫卵，孵化，化蛾，得G0代，使G0代自交，获得G1代；和

3)将步骤2)所述的G1代与表达Cas9蛋白的转基因鳞翅目昆虫交配，获得的G2代，即得雌雄高度不育的鳞翅目昆虫。

优选的，所述的第一Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的第二Ser2基因靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述的Ser2基因敲除核酸构建物还包括第一筛选标记基因表达盒。

优选的，所述的第一筛选标记基因是红色荧光蛋白基因。