[发明专利]合成辛伐他汀的重组菌株、方法以及相关酶

说明书

本发明属于生物技术和药物技术领域，提供了合成辛伐他汀的重组菌株、方法以及相关的酶，其中，所述重组菌株同时表达2‑甲基丁酸侧链水解酶和酰基转移酶。本发明的辛伐他汀合成方法步骤简化，杂质含量低，反应条件温和。

技术领域

本发明属于生物技术和药物技术领域，涉及辛伐他汀的合成。

背景技术

心脑血管疾病已成为人类的头号杀手，发病率逐年上升。高血脂是引起心脑血管疾病的主要原因之一，因此，降低血脂可以有效降低心脑血管疾病的风险。目前临床上采用的调脂药物中以他汀类最为常用。1979年默克公司的科学家从土曲霉的代谢产物中分离到了洛伐他汀，1987年美国FDA批准该物质为世界上第一个批准上市的他汀类药物。接着，该公司又以洛伐他汀为原料合成了辛伐他汀，其C-8位丁酸酯侧链的α-碳原子上比洛伐他汀多一个甲基，二者的作用机制相同。近年来，临床研究表明降低低密度脂蛋白胆固醇效果最好的是阿托伐他汀，其次是辛伐他汀，因此，二者的销售额也在排行榜上名列前茅。而生产辛伐他汀的工艺和成本已成为该产品市场竞争的重要因素。

目前，辛伐他汀的生产工艺主要是化学合成法，如CN1290261A、CN1612872A、CN1493570A所述，基本生产工艺是由两步反应组成，第一步由洛伐他汀生成莫那可林J，第二步由莫那可林J生成辛伐他汀。这些工艺的缺点是转化时间长，反应条件苛刻，环境污染大，需要昂贵和危险的化学试剂。随着生物技术的发展，辛伐他汀的生物合成越来越受到人们的关注。其中第二步反应的生物转化技术已有报道，该反应利用了酰基转移酶，它可以将α-二甲基丁酰巯基丙酸甲酯(DMB-S-MMP)等酰基硫酯的酰基基团转移至莫那可林J的C8位羟基上合成辛伐他汀，如CN102703539A、CN103725726A、CN102695792A、CN102574896A、CN101490271、CN102712678A所述。然而，到目前为止第一步反应的生物转化技术尚不成熟。相关文献报道了一种2-甲基丁酰侧链水解酶(PcEST)，该酶可以特异性地水解洛伐他汀生成莫那可林J，通过将PcEST引入至洛伐他汀高产菌株中，得到了生产莫纳可林J的土曲霉菌株，水解效率高达90％以上(Huang XN,Liang YJ,Yang Y,Lu XF.(2017).Single-stepproduction of the simvastatin precursor monacolin J by engineering of anindustrial strain of Aspergillus terreus.Metab.Eng.,42,109-114)。

然而，这种方式仅是改进了第一步反应，想要得到辛伐他汀还得进行第二步反应，相对繁琐。

发明内容

本发明主要目的是通过在一株微生物体内同时生产2-甲基丁酰侧链水解酶和酰基转移酶，开发出以洛伐他汀和酰基硫酯为底物的高效、低成本、绿色环保的辛伐他汀全生物合成工艺。

在第一个方面，本发明提供一种2-甲基丁酸侧链水解酶，是通过定点突变野生型PcEST(SEQ ID NO:1)得到的突变体，突变位点包括第106位、第140位和第304位，突变形式为D106G、Q140L和S304G，因此，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的序列为：