[发明专利]一种检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法

权利要求书

1.一种检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、接种：取96孔板，选择生长良好的大鼠垂体瘤GH3细胞制备5×10⁴个/mL的细胞悬液，按照200μL/孔接种，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养2-3d；

S2、上样：待细胞贴壁后，取步骤S1得到的96孔板，弃去上清液；取离心管，每个离心管中加入990μL无酚红F12培养基，再加入10μL溶于DMSO的待测样品；另外取离心管，添加10μLDMSO作为对照，按每孔200μL添加于96孔板中，在CO₂培养箱中暴露96h；

S3、反应：反应结束前4h取出步骤S2得到的96孔板，弃去上清液，每孔加入MTT溶液50μL，置于CO₂培养箱中继续孵育4h，待反应产物formazan结晶形成后，小心吸取上清液，加入150μL DMSO终止反应，室温下于96孔板摇床震荡充分溶解还原产物；

S4、样品检测：用酶标仪检测步骤S3待测样品反应液的光密度值；

S5、标准曲线制作：以时间为横坐标，酶标仪检测经过步骤S3反应后不同浓度的T3的反应液的光密度值为纵坐标，绘制剂量－效应标准曲线，将样品的光密度值与标准曲线对比得到样品的T3毒性当量。

2.如权利要求1所述的检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，其特征在于，步骤S1中接种大鼠垂体瘤GH3细胞的方法是：取经过传代培养至对数生长期的大鼠垂体瘤GH3细胞，弃去培养液，加入DMEM胰酶和EDTA进行消化，消化完全后加入胎牛血清终止消化，然后将GH3细胞吹打脱壁，吸至无菌培养瓶中加入培养基调节细胞浓度，混匀后用血小球计数板计数，再接种至96孔板中。

3.如权利要求2所述的检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，其特征在于：消化完全后加入的胎牛血清为新鲜胎牛血清，添加量为2ml。

4.如权利要求2所述的检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，其特征在于，所述大鼠垂体瘤GH3细胞的培养方法如下：

(a)冻存：在F10培养基中加入10％-50％血清和8％DMSO配制成冻存液，将大鼠垂体瘤GH3细胞在冻存液中混匀，加入冻存管中，离心后吸出上清液，再加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存；

(b)复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于温水中水浴融化，离心、吸去上清液，加入10mL含15％胎牛血清和5％马血清的F10培养基吹散均匀，置于5％CO2的恒温箱37℃条件下培养；

(c)传代培养：24h后取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用PBS缓冲液清洗3遍，加入0.05％DMEM胰蛋白酶和2.5％EDTA在37℃条件下消化1min，加入含15％胎牛血清与5％马血清的F10培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新的含15％胎牛血清和5％马血清的F10培养基，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养。

5.如权利要求1所述的检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，其特征在于：酶检测仪检测光密度值的波长为490nm。