[发明专利]一种检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法

说明书

本发明公开了一种检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，采用大鼠垂体瘤GH3细胞作为检测手段，半贴壁培养至指数生长期，加入环境样品的有机溶剂提取液，继续培养后，加入MTT溶液，通过酶标仪490nm波长检测光密度值，以3,3',5‑三碘‑L‑甲腺原氨酸(下简称T3)为标准化合物，绘制T3对GH3细胞的生长诱导的剂量‑效应关系标准曲线，进而评价样品中甲状腺激素干扰物的毒性效应。本方法快速简便、成本低廉、省时省力，能够到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值，可以作为环境样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。

技术领域

本发明涉及环境检测技术领域，尤其涉及检测环境中甲状腺激素 干扰物诱导活性的方法。

背景技术

甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官，其分泌的 甲状腺激素是体内至关重要的新陈代谢调节物，在促进机体基础代谢、 生长发育等方面发挥重要作用。如果胎儿发育期间甲状腺激素缺乏， 将导致体型矮小、智力迟钝、骨骼营养不良以及新陈代谢低下等一些 不良症状。同时，与中枢神经系统成熟相关的过程以及骨骼、肝脏和 血液等的发育和功能维持都离不开甲状腺激素的调控。

近年来不断有研究证明，环境中的一些内分泌干扰物能影响下丘 脑－腺垂体－甲状腺作用轴。这类影响生物体甲状腺激素的合成、分 泌、运输、作用和代谢等过程的化合物统称为甲状腺激素干扰物 (TDCs，Thyroid Disrupting Chemicals)。

由于甲状腺激素在基础代谢以及生长发育调节方面的重要作用， 甲状腺激素干扰引起了科学界巨大的关注，同时环境甲状腺激素干扰 物也成为继环境雌激素污染后最重要的一类内分泌干扰物。现有甲状 腺激素干扰物的鉴别与毒性评价方法，主要有体外测试方法(in-vitro) 与活体测试方法(in vivo)两种，离体方法主要有T-screen筛选方法、重组雌激素受体基因酵母测试方法等；活体测试根据研究者研究领域 等方面的不同，有利用非洲爪蟾、大鼠、兔、鸡及鱼的。但现有这些 检测方法存在操作复杂，而且时间长，费用高，难以满足现有的快速 筛查的需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测环境 中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，该方法快速简便、成本低廉、 省时省力，能够反映环境样品中甲状腺激素干扰物效应，并通过标准 曲线计算得到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值，可以作为环境 样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

采用大鼠垂体瘤GH3细胞作为检测手段，半贴壁培养至指数生 长期，加入环境样品的有机溶剂提取液，继续培养后，加入MTT溶 液，通过酶标仪490nm波长检测光密度值，以3,3',5-三碘-L-甲腺原 氨酸(简称T3)为标准化合物，绘制T3对GH3细胞的生长诱导的 剂量-效应关系标准曲线，进而评价样品中甲状腺激素干扰物的毒性 效应。

本发明检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的具体方法如下：

S1、接种：取96孔板，选择生长良好的大鼠垂体瘤GH3细胞制 备5×10⁴个/mL的细胞悬液，按照200μL/孔接种，于含5％CO₂的培 养箱中37℃条件下培养2-3d；

S2、上样：待细胞贴壁后，取步骤S1得到的96孔板，弃去上清 液；取离心管，每个离心管中加入990μL无酚红F12培养基，再加 入10μL溶于DMSO的待测样品；另外取离心管，添加10μL DMSO 作为对照，按每孔200μL添加于96孔板中，在CO₂培养箱中暴露96h；

S3、反应：反应结束前4h取出步骤S2得到的96孔板，弃去上 清液，每孔加入MTT溶液50μL，置于CO₂培养箱中继续孵育4h， 待反应产物甲瓒(英文：formazan)结晶形成后，小心吸取上清液， 加入150μL DMSO终止反应，室温下于96孔板摇床震荡充分溶解还 原产物；