[发明专利]一种双特异性抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双特异性抗体，其从N端到C端包含：

肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体；

重链恒定区；和

免疫细胞表面抗原对应抗体。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或，所述免疫细胞表面抗原对应抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:13或14所示；优选地，所述双特异性抗体为Fc单链构型。

4.一种编码双特异性抗体的核苷酸序列，其从5’端到3’端包含：

编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列；

编码重链恒定区的核苷酸序列；和

编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的编码双特异性抗体的核苷酸序列，其中，所述编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；和/或，所述编码重链恒定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；和/或，所述编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示。

6.如权利要求4所述的编码双特异性抗体的核苷酸序列，其中，所述编码双特异性抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:19或20所示。

7.一种双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)以人血液总RNA反转录的cDNA为模板，根据引物扩增出编码重链恒定区的核苷酸序列、编码肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的核苷酸序列、编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列，

其中，免疫细胞为NK细胞或T细胞，NK细胞表面抗原为CD16a，T细胞表面抗原为CD3；

其中，扩增所需的引物为：

引物1，正向引物：CCCAAGCTTAGCTTTCTGGGGCGAGCCGG(SEQ ID NO:5)，酶切位点为HindIII；

引物2，反向引物：CCGGAATTCGACCCACTCTGCCTCCCTCAT(SEQ ID NO:6)，酶切位点为EcoRI；

引物3，正向引物：CCGCTCGAGCCTAGAACCATGTCACCCTGACCT(SEQ ID NO:7)，酶切位点为XhoI；

引物4，反向引物：CCCAAGCTTCAAGGCGCGACAGCTGCCCTAG(SEQ ID NO:8)，酶切位点为HindIII；

引物5，正向引物：CCGCTCGAGGTCCTGAASGAGTCTACTCCCTC(SEQ ID NO:9)，酶切位点为XhoI；

引物6，反向引物：CCCAAGCTTCTCTCCACAAGCACAACACGCA(SEQ ID NO:10)，酶切位点为HindIII；

引物7，正向引物：CCGGAATTCGCTCATATGTAGTGTCGAGTGCG(SEQ ID NO:11)，酶切位点为EcoRI；

引物8，反向引物：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG(SEQ ID NO:12)，酶切位点为XbaI；

其中，引物1、引物2用于扩增编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列，引物3、引物4用于扩增编码CD3对应抗体的核苷酸序列，引物5、引物6用于扩增编码作为免疫细胞表面抗原对应抗体的序列的CD16a对应抗体的核苷酸序列，引物7、引物8用于扩增编码作为免疫细胞表面抗原对应抗体的序列的GPC3对应抗体的核苷酸序列；

扩增出的编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列的一端和编码GPC3对应抗体的核苷酸序列具有相同的酶切位点，

扩增出的编码抗体的重链恒定区的核苷酸序列的另一端和编码免疫细胞表面抗原对应抗体的核苷酸序列具有相同的酶切位点；

(2)将扩增序列利用酶切、连接获得拼接序列；其中，拼接序列为编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD16a对应抗体的核苷酸序列，或编码GPC3对应抗体的核苷酸序列-编码重链恒定区的核苷酸序列-编码CD3对应抗体的核苷酸序列；

(3)对获得的拼接序列利用载体构建包含拼接序列的质粒；

(4)将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体；

优选地，所述哺乳动物细胞为293T细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；

优选地，构建质粒的载体为pcDNA6-Myc/His B。