[发明专利]检测SA肠毒素SEI的试剂及制备方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测SA肠毒素SEI的试剂的制备方法，其特征在于主要包含以下过程：

SA的培养及其基因组DNA的提取：将SA接种在LB液体培养基中培养，取对数生长期的SA培养液离心处理，收集菌体，弃上清，菌体用TE缓冲液悬浮后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取SA基因组DNA，待用；

SA肠毒素SEI基因扩增引物的设计：根据已有SA肠毒素SEI基因序列设计扩增SEI基因序列的特异性引物，在上游引物和下游引物5'端分别引入BamHI和HindIII限制性酶切位点，同时，设计扩增该基因的荧光定量RT-PCR引物，

SA肠毒素SEI基因的扩增与克隆：配制PCR反应体系，该反应体系包括：SA基因组DNA模板，10×PCR buffer，dNTPs，上游引物SEI FP1、下游引物SEI RP1，ddH₂O，Taq DNA聚合酶，将所有试剂加入PCR反应管中并充分混匀，在不同温度段下进行PCR反应，用1-2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将扩增产物电泳后进行回收，与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，经氨苄青霉素抗性平板筛选及菌液PCR验证后，获得重组质粒pT-SEI，

SA肠毒素SEI基因的表达：按照分子克隆的方法，将含有SEI基因片段的重组质粒重组质粒pT-SEI与原核表达pET-28a(+)质粒分别用BamHI和HindIII限制性内切酶进行双酶切，然后分别回收目的片段和载体片段，用T4DNA连接酶进行过夜连接，并将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中36-38℃振荡培养12-24小时，构建pET-SEI重组表达质粒，

按照分子克隆常规方法，将鉴定正确的pET-SEI重组表达质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21中，用IPTG诱导培养6-8h，离心收集菌液并加入Lysis Buffer裂解菌体，液氮和40-45℃水浴反复冻融2-5次后进行超声破碎，每次8-12s，间歇8-12s，80-100次/周期，直至菌液清亮为止，得到SA重组肠毒素SEI，冷冻保存。

2.根据权利要求1所述的检测SA肠毒素SEI的试剂的制备方法，其特征在于：

SA的培养及其基因组DNA的提取为：将SA接种在LB液体培养基中，36-38℃培养，取对数生长期的SA培养液在5500-6500r/min离心15min。

3.根据权利要求2所述的检测SA肠毒素SEI的试剂的制备方法，其特征在于：

SA肠毒素SEI基因的扩增与克隆为：配制PCR反应体系，反应体系包括：SA基因组DNA模板、10×PCR buffer、dNTPs、上游引物SEI FP1、下游引物SEI RP1、ddH₂O和Taq DNA聚合酶，将所有试剂加入PCR反应管中，并充分混匀，在不同温度条件循环反应，得扩增产物，将扩增产物电泳后进行回收，与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，经氨苄青霉素抗性平板筛选及菌液PCR验证后，获得重组质粒pT-SEI。

4.一种检测SA肠毒素的试剂，其特征在于：根据权利要求1-3任一项所述的方法制备得到SA重组肠毒素SEI。

5.一种检测SA肠毒素的试剂盒，其特征在于：包含免疫层析试纸条，所述的免疫层析试纸条包含加样垫、结合垫、NC膜，吸收垫和PVC塑料垫5个部分组成，在NC膜上设置检测线和质控线，

结合垫制作：取一片NC膜，在该NC膜上均匀滴加制备好的胶体金标记抗SA肠毒素SEI单克隆抗体IgG，在真空干燥箱中36-38℃干燥8-12min，作为结合垫，

在设有检测线和质控线的NC膜的检测线上包被经PBS缓冲液稀释至1-3mg/mL的SA重组肠毒素SEI，在质控线上包被1-3mg/mL的羊抗鼠IgG，常温下干燥25-35min，

组装的顺序依次为：在PVC板的中间区域贴上NC膜，结合垫贴在NC膜的前方区域；结合垫压NC膜1-3mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫1-3mm，最后将吸水垫在NC膜的后方，吸水垫压NC膜1-3mm，用试纸条切割刀切成条状，低温储存备用；

所述胶体金标记抗SA肠毒素SEI单克隆抗体IgG为：胶体金溶液与抗SA肠毒素SEI单克隆抗体之比为按体积比为1：4-1：6的溶液，所述胶体金溶液颗粒直径为20-100nm，与抗SA肠毒素SEI单克隆抗体混合后，在3-5℃恒温下缓慢振荡20-40min，12000-14000r/min离心3--50min，弃去上清液，沉淀物溶解于0.05-0.15moL/L、pH＝7.9-8.1的Tris-HCL缓冲溶液中备用。