[发明专利]草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定

权利要求书

1.草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、克隆得到草鱼ICAM-1编码序列：从草鱼基因组中找到ICAM-1的序列，设计引物，从草鱼头肾组织中克隆得到草鱼ICAM-1的编码序列和氨基酸序列；

所述引物：gcICAM-1CDSF 5’TTTCTAAAGCCCAGTACTAGAG 3’，gcICAM-1CDSR 5’TGGCAGATGCAGCAAACCCAG 3’；

所述草鱼ICAM-1的编码序列如SEQ ID No.1所示；所述草鱼ICAM-1的氨基酸序列如SEQID No.2所示；

S2、提取草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒：对草鱼ICAM-1的编码序列进行酶切位点扫描分析，对照载体pcDNA3.1/myc-His(-)的多克隆位点上的酶切位点，选择目的基因编码序列所不含的酶切位点作为构建质粒的酶切位点，设计含有酶切位点的引物，PCR扩增，进行胶回收产物，然后进行双切酶消化反应，用连接酶将其连接到所需载体，在42℃热激转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并培养，提取草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒；

S3、ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达：设定温度下，将草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒转染到含COS-7细胞的培养基中，转染表达；

S4、草鱼血淋巴细胞的分离及染色：用断颈法收集草鱼血液按1:1加入培养基并混匀，通过密度梯度离心处理得到草鱼血淋巴细胞，将得到的草鱼血淋巴细胞分为两份，其中一份加入细菌脂多糖进行处理后，向两份草鱼血淋巴细胞加入荧光染料进行孵育染色处理；

S5、草鱼血淋巴细胞的粘附实验：将荧光染料标记的草鱼血淋巴细胞加入转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中孵育；将同样数目未经荧光染料染色的细胞加入到转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中孵育作为负对照，孵育结束后，用预热的缓冲液洗除去未粘附的细胞，对粘附的细胞分别进行荧光测试。

2.根据权利要求1所述的草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定方法，其特征在于，所述的步骤S2中含酶切位点的引物：

gcICAM-1EXF 5’ccgctcgagaagATGGCGAAGCAGTCGTTTTTTCT 3’，

gcICAM-1EXR 5’cggggtaccAGCAAAGATATTGCTCTGAGAG 3’。

3.根据权利要求1所述的草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定方法，其特征在于，所述的步骤S3的具体操作如下：将1μg pcDNA3.1/myc-His(-)或者pcDNA3.1/myc-His/gcICAM-1质粒和1.5μl Lipofectamine 2000试剂在500μl的无血清DMEM培养基中混合，室温下孵育15分钟；用PBS缓冲液洗涤24孔板中的COS-7细胞三次，将转染混合物加入其中；转染4小时后，将转染混合物换成含10％FBS的DMEM培养基，培养48小时后供细胞粘附实验使用。

4.根据权利要求1所述的草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定方法，其特征在于，所述的步骤S4的具体操作如下：

(ⅰ)分离：用断颈法处死草鱼，注射器收集血液，迅速加入含50mg肝素钠且不含FBS的RPM-1640培养基按1:1混匀；在50ml的离心管中加入8ml密度为1.083kg/l的Histopaque溶液，再在其上轻轻加入等体积的稀释的草鱼血液；在吊桶离心机上以转速1600g离心30分钟，收集Histopaque溶液和培养基界面的细胞即为草鱼血淋巴细胞；

(ⅱ)染色：用台盼蓝染色检查活细胞数目，然后用含有10％的RPM-1640培养基重悬细胞，并将细胞转入培养基中培养过夜后，收集细胞并分为两份，其中一份用20μg/ml的细菌脂多糖处理1小时；收集细菌脂多糖处理或未处理细胞与5μM calcein-AM在室温下孵育15分钟；未能进入细胞的calcein-AM染料用草鱼血淋巴细胞洗涤三次去除；该染色细胞用于下述的粘附实验。

5.根据权利要求1所述的草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定方法，其特征在于，所述的步骤S5的具体操作如下：将荧光染料即calcein-AM标记的草鱼血淋巴细胞浓度调整为3.33×10⁶个/ml，取300μl细胞悬液加入转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中，并在27℃孵育2个小时；同样数目未经calcein-AM染色的细胞也加入到转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中作为负对照；孵育结束后，未粘附的细胞用预热的PBS轻轻洗涤除去；粘附细胞的荧光用尼康荧光显微镜观察；粘附的细胞用含有0.1％Triton X-100的PBS融解，细胞内的calcein被释放，用荧光计数器测量荧光强度。