[发明专利]草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定

说明书

本发明涉及草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定，包括以下步骤：克隆得到草鱼ICAM‑1编码序列；提取草鱼ICAM‑1活性蛋白的重组表达质粒；ICAM‑1蛋白在COS‑7细胞中的表达；草鱼血淋巴细胞的分离及染色；草鱼血淋巴细胞的粘附实验。本发明的技术特点是：ICAM‑1对淋巴细胞跨内皮细胞作用是必需的，该基因分离鉴定可用于鱼类免疫学机制研究；血清中存在着可溶性的ICAM‑1（sICAM‑1），它来自于蛋白酶切割膜形式的ICAM‑1；在临床上，检测血清中的sICAM‑1水平可用于辅助诊断鱼病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用分子生物学和细胞生物学方法获得并鉴定草鱼细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的基因序列。

背景技术

细胞粘附分子是分布在细胞表面的一类蛋白质，它们可介导细胞与细胞，细胞与介质之间的相互作用。在免疫系统中，细胞粘附分子对于白细胞的运输和分化具有不可替代的作用。它们不仅可直接激活细胞信号转导通路，并且可在其他受体信号转导过程中保持必要的细胞与细胞接触。因为以细胞物理接触为基础的细胞通讯对免疫反应的协调进行具有重要作用，因此粘附分子在免疫系统中发生的抗体识别作用、共刺激作用和细胞粘附中都扮演了重要的角色。

细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是一类属于免疫球蛋白超家族的单次跨膜糖蛋白。ICAM-1的表达可被细菌脂多糖(LPS)，佛波酯和一些细胞因子，比如:白介素-1，TNF-和IFN-诱导表达。ICAM-1在炎症和免疫相关进程中发挥着重要作用。特别地，它能作为辅助刺激分子在白细胞跨内皮层迁移和T细胞激活中发挥重要作用。目前，多种ICAM-1的配体已被发现，包括淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，巨噬细胞1，抗原鼻病毒，纤维蛋白原和恶性疟原虫感染红细胞。至今，鱼类ICAM-1还未见报道，且草鱼的ICAM-1分子还未发现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种草鱼细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因的分离和鉴定方法。本发明发现了草鱼基因组中一个可以编码介导草鱼ICAM-1的基因，并用细胞生物学的方法证实它能特异介导血淋巴细胞(PBLs)的粘附。为实现本发明的目的，本发明提供了包括基因克隆、粘附分子成熟蛋白表达质粒的构建、粘附分子表达质粒的转化、草鱼血淋巴细胞粘附等方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：草鱼细胞间粘附分子基因的分离和鉴定，其特征在于，包括以下步骤：

S1、克隆得到草鱼ICAM-1编码序列：从草鱼基因组中找到ICAM-1的序列，设计引物，从草鱼头肾组织中克隆得到草鱼ICAM-1的编码序列和氨基酸序列；

S2、提取草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒：对草鱼ICAM-1的编码序列进行酶切位点扫描分析，对照载体pcDNA3.1/myc-His(-)的多克隆位点上的酶切位点，选择目的编码序列所不含的酶切位点作为构建质粒的酶切位点，设计含有酶切位点的引物，PCR扩增，进行胶回收产物，然后进行双切酶消化反应，用连接酶将其连接到所需载体，在42℃热激转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并培养，提取草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒；

S3、ICAM-1蛋白在COS-7细胞中的表达：设定温度下，将草鱼ICAM-1活性蛋白的重组表达质粒转染到含COS-7细胞的培养基中，转染表达；

S4、草鱼血淋巴细胞的分离及染色：用断颈法收集草鱼血液按1:1加入培养基并混匀，通过密度梯度离心处理得到草鱼血淋巴细胞，将得到的草鱼血淋巴细胞分为两份，其中一份加入细菌脂多糖进行处理后，向两份草鱼血淋巴细胞加入荧光染料进行孵育染色处理；

S5、草鱼血淋巴细胞的粘附实验：将荧光染料标记的草鱼血淋巴细胞加入转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中孵育；将同样数目未经荧光染料染色的细胞加入到转染有ICAM-1表达质粒或空载的COS-7细胞中孵育作为负对照，孵育结束后，用预热的缓冲液洗除去未粘附的细胞，对粘附的细胞分别进行荧光测试。