[发明专利]一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法

说明书

本发明公开了一种mPEG‑Mal5000修饰β‑淀粉酶的方法，mPEG‑Mal5000作为修饰剂，最佳修饰工艺参数为mPEG‑Mal5000添加比例为1:4、修饰反应温度为58℃、修饰反应pH为6.0，反应时间为10min。mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶的比酶活力为（2.08±0.055）万U/mg，酶活比未修饰β‑淀粉酶提高了20.10%；修饰后酶动力学参数K_m降低了12.95%，V_max提升了26.87%，在温度为30℃‑70℃时，mPEG‑β‑淀粉酶耐热性明显高于β‑淀粉酶耐热性。在pH6.5‑7.5时，mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶pH稳定性明显高于β‑淀粉酶pH稳定性。

技术领域

本发明属于甘薯生物活性物质提取技术领域，具体涉及一种响应面法优化mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法。

背景技术

β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)是外切型糖化酶，它从淀粉分子的非还原性末端，按α-1,4糖苷键顺次切下麦芽糖单位，并在切断麦芽糖的同时发生瓦尔登转化，使产物由α型变为β型麦芽糖。β-淀粉酶主要应用于食品、发酵、纺织、制药等工业过程中。β-淀粉酶广泛存在于高等植物中，如甘薯、大麦、小麦、大豆等。甘薯中β-淀粉酶是块根中仅次于甘薯贮藏蛋白的一种蛋白质成分，而其他高等植物中仅含有痕量酶。甘薯β-淀粉酶是从新鲜甘薯制备淀粉的废液中提取分离，具有生物活性的蛋白质大分子，其热稳定性是制约甘薯β-淀粉酶在食品工业中应用的关键因素。

随着淀粉糖行业的迅猛发展，高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆的产量迅速扩大，β-淀粉酶的应用范围越来越广，而β-淀粉酶的研究尚未取得较大突破，目前甘薯β-淀粉酶在高温下性质不稳定，环境条件如pH、压力、温度和离子强度等稍微变化，酶就会失去活性，因此，提高甘薯β-淀粉酶热稳定性和酶活极其重要。

酶分子化学修饰是指通过化学手段剪接切割酶的主链或者修饰侧链，从而提高酶的稳定性、生物活性或者延长酶的半衰期，创造出天然酶不具备的某些优良性状，修饰酶得到越来越广泛的应用。蛋白质的化学修饰可应用于医药领域及生物催化剂领域。在医药领域，不同种类的蛋白药物，包括酶、细胞因子、抗体等经过聚乙二醇修饰后其理化性质显著改良。

酶修饰技术在β-淀粉酶研究上也有进一步的发展。在蛋白质的化学修饰中，修饰剂的选择极为重要，它不但关系到修饰反应能否顺利进行，而且对修饰的效果有着重要的影响。当前用来对蛋白质进行化学修饰的修饰剂很多，其中应用最广泛的是聚乙二醇，聚乙二醇是一种可溶性惰性聚合物，既溶于水，也溶于有机溶剂，它没有免疫原性和毒性，不会破坏生物分子的活性，其次是多糖类，如右旋糖苷、聚蔗糖、淀粉、壳聚糖、β-环糊精，琼脂糖等；另外，长链脂肪酸类以及聚烯属烃基氧化物等，如硬脂酸、月桂酸、棕搁酸等。

目前，用于食品中酶分子修饰的修饰剂有壳聚糖、聚乙二醇、和戊二醛等。如前所述，以壳聚糖和戊二醛作为修饰剂时，仅能提高酶的稳定性，酶活力均有损失。

随着工业的发展，对酶量的需求会越来越大，对酶的种类要求也会越来越多，对酶的稳定性要求会越来越高。为满足工业上越来越多的要求，酶修饰技术应用会越来越广泛为了提高酶的活力稳定性等性质，酶修饰技术的研究还要更加深入。