[发明专利]一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法

说明书

本发明涉及一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b‑Fab片段的制备方法，包括以下步骤：1、采用木瓜蛋白酶酶解单克隆抗体IgG2b后，透析、离心，得上清液；2、分别将琼脂糖‑Protein G和琼脂糖‑Protein L装入层析柱，用结合Buffer进行平衡；3、将上清液泵入琼脂糖‑Protein G层析柱中，收集流出液；用洗杂Buffer清洗，再用洗脱Buffer洗脱，收集洗脱液A，即Fc片段；4、将流出液泵入琼脂糖‑Protein L层析柱中，用洗杂Buffer清洗，再用洗脱Buffer洗脱，收集洗脱液B，即IgG2b‑Fab片段。本发明操作简单易控，重复性强、获得的Fab片段纯度高。

技术领域

本发明属于抗体的制备领域，具体涉及一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法。

背景技术

临床治疗犬细小病毒病采用最多的药剂为单克隆抗体，由于单克隆抗体特异性极强，可到达病毒侵染的组织和细胞而中和病毒，达到治愈的目的，是目前世界上用于治疗和预防犬细小病毒效果较好的生物制剂。采用的犬细小病毒单克隆抗体IgG分子上，Fab片段是与抗原结合的部位，可以中和病毒；Fc片段是IgG与效应分子或者细胞相互作用的部位。由于通常采用的单克隆抗体是鼠源性IgG，病犬反复或者长期使用，IgG中Fc片段的鼠源成分会使犬的机体创造出的一种新型抗体，从而不利于犬细小病毒单克隆抗体的治疗；而Fab片段不仅能够保证抗体和抗原结合的特性，避免了机体产生新型抗体的可能性，此外，还由于Fab片段中不存在Fc段，且Fab片段的分子量较小，可以更快的到达病毒侵染的组织和细胞而中和病毒，达到快速治愈的目的。因此，消化IgG，获得纯化的Fab片段成为避免新型抗体产生的关键。

而目前，纯化IgG-Fc片段和IgG-Fab片段的主要技术手段是离子交换法，此种方法缺点较多，比如纯化的片段纯度不高，有残存的木瓜蛋白酶和IgG-Fc片段污染，对于临床治疗患犬细小病毒的病犬带来麻烦，且相互有污染，步骤麻烦，不易操作，重复性差，抗体片段损失较多等。因此，需要研发一种操作简单易控，重复性强、且可获得高纯度的Fab片段的犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，其操作简单易控，重复性强、且可获得高纯度的Fab片段。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种犬细小病毒单克隆抗体IgG2b-Fab片段的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、采用木瓜蛋白酶酶解犬细小病毒单克隆抗体IgG2b后，装入截留分子量小于10KD的透析袋中，于结合Buffer中进行透析，然后将酶解液于4℃12000rpm离心20min，弃沉淀，得上清液；

所述酶解用酶解体系为：10mg/mL犬细小病毒单克隆抗体IgG2b，0.5mg/ml木瓜蛋白酶，10mmol/L-半胱氨酸，2mmol/L EDTA，去离子水定容，pH7.6；酶解时间4h；

步骤二：将琼脂糖-Protein G和琼脂糖-Protein L分别装入层析柱中，分别用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，得琼脂糖-Protein G层析柱和琼脂糖-Protein L层析柱，备用；

步骤三、将步骤一所得的上清液泵入琼脂糖-Protein G层析柱中，收集流出液；然后用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fc片段，收集洗脱液A，即Fc片段；

步骤四、将步骤三收集的流出液泵入琼脂糖-Protein L层析柱中，然后10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，再用5-10倍柱体积的洗脱Buffer洗脱Fab片段，收集洗脱液B，即IgG2b-Fab片段。