[发明专利]一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒及扩增方法

说明书

本发明公开了一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒及扩增方法，其中，所述扩增试剂盒在同一扩增体系中同时扩增CBS 844ins68位点和CBS C699T位点，CBS 844ins68位点的扩增模板选自序列表SEQ ID NO:1所示的序列中，CBS C699T位点的扩增模板选自序列表SEQ ID NO:2所示的序列中。本发明采用本发明采用多重PCR的扩增方法，同时扩增CBS的多个重要SNP位点，且可以根据实际需要灵活选择扩增的位点组合，可以起到一盒多用的作用，试剂盒中的引物特异性高，错配率低，引物长度和T_m值设计合理，扩增产物便于检测分离。

技术领域

本发明涉及一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒及扩增方法，属于诊断试剂盒领域。

背景技术

流行病学调查发现，轻-中度高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)是动脉粥样硬化和脑梗死(cerebral infarction，CI)重要的新的独立危险因素，而且血浆同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平与CI患者的病情严重程度呈正相关，Hcy是一种含硫氨基酸，体内不能合成，只能从食物中的蛋氨酸(亦称甲硫氨酸)脱甲基后转变而来，Hcy在细胞内的代谢主要通过3种途径，主要涉及到的代谢酶有二甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、蛋氨酸合成酶(MS)、蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)和胱硫醚β－合成酶(CBS)等。目前，关于MTHFR和MTRR的研究已较为成熟，临床中作为诊断标志使用的也较多，但CBS的研究一直未受到重视。

CBS是Hcy转硫基过程中的重要酶，人类CBS基因为常染色体隐性遗传。目前已发现的突变形式有17种，但其恶性突变如T833C、G919A等在人群中的比重小于1％，研究意义远小于844ins68、C699T、T1080C等良性突变，并且这些良性突变已被证实与HHcy的发病密切相关。因此，对于CBS基因的良性突变进行快速诊断分型，对于医学研究及临床诊断均有十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以CBS的良性突变为基础，获得一种脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒及扩增方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的脑梗早期诊断标志物的快速扩增试剂盒的技术方案如下：

本发明所述的快速扩增试剂盒以人血浆内胱硫醚β－合成酶(CBS)作为脑梗早期诊断标志物，所述试剂盒包括两对扩增引物、Taq酶、dNTPs和扩增体系缓冲液，其中扩增引物用于扩增CBS 844ins68位点和CBS C699T位点，CBS 844ins68位点的扩增模板选自序列表SEQ ID NO:1所示的序列中，CBS C699T位点的扩增模板选自序列表SEQ ID NO:2所示的序列中。

本扩增试剂盒主要针对两个对CBS的含量有较为重要影响的单核苷酸多态性(SNP)位点进行扩增，且该扩增可以在同一体系中进行，扩增时间、扩增体系及仪器等消耗均减少一半左右，不仅节约了资源，且一次性得到了两个扩增片段，对于后续的测序和实验具有更广泛的用途，同时对这两个位点进行扩增后检测，对于疾病的发病种类、发病率的风险预测、发病后的诊断和治疗均有准确地指导意义。突变位点位于序列中，具体的扩增模板起始位点及长度可以根据具体的扩增方法不同而进行调整，并不限制于本发明中的扩增位点。

本发明中的扩增方法针对性地对上述两个位点设计了特异性引物，该特异性引物可以在多个模板DNA共存状态下准确识别并特异性地扩增对应的目标片段，扩增特异性高，非特异性条带少，扩增片段可简单分离后进行后续检测。经申请人多次重复试验后，优选的同时采用两组特异性引物的扩增效果最好，扩增CBS 844ins68位点的上游引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO:4所示，扩增CBS C699T位点的上游引物序列如序列表SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO:6所示。