[发明专利]基于微流控芯片的降钙素原检测试剂盒及制备和检测方法

说明书

本发明公开了一种基于微流控芯片降钙素原PCT试剂盒及其制备和检测方法，该试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被；(2)荧光微球标记；(3)微流控芯片组装；(4)定标品的制备；(5)得基于微流控芯片的降钙素原PCT试剂盒。制备得到的PCT试剂盒采用双抗体夹心法进行测定，选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗体的标记，利用抗体对的免疫反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平。免疫反应后，使用清洗液将多余组分完全去除后，对免疫反应结合上的荧光微球进行检测读数，避免了引入显色液进入芯片内部反应不充分或者显色后读数不及时的问题。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种基于微流控芯片的降钙素原检测试剂盒及其制备和检测方法。

背景技术

降钙素原(Procalcitonin，PCT)作为降钙素的前体蛋白，是由116个氨基酸组成的激素原，分子量约为13千道尔顿。PCT在甲状腺、肺部和胰腺组织的C细胞中表达，经酶分解后会分解为降钙素(32个氨基酸)、抗钙素(21个氨基酸)和氨基端肽(57个氨基酸)。健康人群血液中仅有极少量的PCT。人体感染细菌后，PCT水平会有明显升高，体内的多种组织中会分泌表达PCT。PCT在感染后2～3小时浓度水平即可上升，6～12小时达到顶峰，48小时内保持较高的水平，2天后下降至基线水平。

PCT用于细菌性脓毒症的早期诊断及监测，尤其是重症脓毒症和感染性休克，其PCT浓度水平与感染程度成正比。PCT也可用作脓毒症的预后评估指标，作为临床治疗及监控的措施之一。对于急性重症胰腺炎及相关并发症，PCT也是一个良好的监测指标。对于呼吸道相关炎症及感染，PCT对抗生素选择、使用及疗效判断起到指导作用。PCT除了感染类相关病症的诊断及监测外，以下情况下会造成PCT水平的升高。例如：外科手术和严重烧伤创伤、肝移植和心脏移植、肾功能不全、甲状腺髓样细胞癌或甲状腺滤泡癌、白血病、B细胞淋巴瘤、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎。

PCT与传统炎性指标对比，更具有特异性和灵敏度。PCT与WBC计数相比，WBC在不同细菌感染下可以是升高的，甚至有些是降低的，且影响WBC计数的因素较多；PCT与ESR相比，ESR在风湿性疾病、结核分枝杆菌感染、心血管疾病的患者血清中也会明显升高；PCT与CRP相比，PCT在全身严重细菌感染时，比CRP更早、更快速的出现，且感染控制后也比CRP更快回到正常水平；PCT与IL-6相比，IL-6的半衰期较短(几分钟至几小时内)，检测结果受采样时机的影响，稳定性差[4]。因此它可能成为一项快捷、有效的常规实验指标，帮助临床诊断、鉴别诊断、疗效观察与指导用药，使患者能早日康复。

降钙素原急诊临床应用专家共识组于2012年发表了的《降钙素原(PCT)急诊临床应用的专家共识》，建议了PCT参考值范围，PCT急诊临床应用的专家共识推荐的参考范围如下：

在中国专利文献CN104614521A中公开了一种微流控芯片，包括柔性聚合物层和基片，柔性聚合物层和基片键合在一起，所述芯片中设有微沟道系统，所述微沟道系统包括缓冲液入口、样品入口、磁珠入口、废液出口、微阀、微泵区、磁珠塞区、循环区及检测区。

上述技术方案采用灵敏度较低的比浊法，检测免疫磁珠和待测物之间的免疫反应所形成的络合物进行反应物前后的浊度变化，来进行判定待测物的浓度。相对而言，在采用免疫比浊这一方法学来说，由于不需要额外的配对抗体以及发光标记物，因此整体芯片结构设计较为简单。通过磁场在芯片沟道中形成的特定区域富集磁珠，样品持续通过此部分磁珠塞后与另一测磁珠结合，从而形成两个以上的磁珠团聚。

采用其他现有技术或(1)芯片的结构过于复杂，无法对反应做出精确的调控，清洗步骤以及液体传导存在较大的污染；或(2)使用了多个液体腔室和固相载体(磁珠以及荧光微球同时使用)，试剂整体设计过于复杂；或(3)免疫反应采用了非均相反应，意为固相载体与固相载体的表面进行反应，反应不充分，灵敏度和重复性受到限制。