[发明专利]一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法

权利要求书

1.一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成用于血红蛋白和糖化血红蛋白定量的特性肽段；

(2)特征肽段纯度的测定；

(3)糖化血红蛋白的酶解；

(4)样品酶解液的毛细管电泳-同位素稀释质谱分析：在酶解后的酶解液中加入同位素标记的VH*LTPE和Glc-VH*LTPE，混合均匀后用0.22μm滤膜过滤进行毛细管电泳-同位素稀释质谱分析；

使用的分离毛细管为57cm×75μm聚酰亚胺涂层石英毛细管，紫外检测器，检测波长200nm，50mM pH＝5.0的醋酸铵缓冲液作为分离介质；同时作为鞘液，鞘液流速0.2mL/min；

压力进样，分离电压为20kV，质谱检测采用选择性检测以下离子峰：m/z＝695，VHLTPE；m/z＝702，D7-VHL*TPE；m/z＝857，G-VHLTPE；m/z＝864，D7-G-VHLTPE；同时采用合成的VHLTPE、VH*LTPE、Glc-VHGLTPE及Glc-VH*LTPE配制低标和高标，采用括号法对酶解液中的VHLTPE和Glc-VHLTPE进行准确测定；测定完成后，对括号法高低标及样品中标记与非标记肽段的峰面积进行积分；

(5)酶解液中特异性肽段含量的计算：根据下述公式，计算酶解液中VHLTPE和Glc-VHLTPE的含量，

式中：c—为样品中VHLTPE或Glc-VHLTPE的含量，mg/g；

m_s——为样品溶液中VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的质量，mg；

R_s——为样品溶液中VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的峰面积比；

I₁——为高标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的质量比；

I₂——为低标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的质量比；

R₁——为高标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的峰面积比；

R₂——为低标溶液VHLTPE或Glc-VHLTPE与VH*LTPE或Glc-VH*LTPE的峰面积比；

M—为样品质量，g；

P—为VHLTPE或Glc-VHLTPE的纯度；

(6)糖化血红蛋白含量的计算：根据下面的公式，计算样品中糖化血红蛋白的含量，

式中，

m_Glc-VE6——酶解液中Glc-VHLTPE的含量，g/g；

MW_Glc-VE6——Glc-VHLTPE的分子量；

m_VE6——酶解液中VHLTPE的含量，g/g；

MW_VE6——VHLTPE的分子量。

2.根据权利要求1所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为，通过化学合成的方式获得用于血红蛋白定量的特异性肽段VHLTPE及其对应的同位素标记肽段VH*LTPE；通过化学合成的方式获得用于糖化血红蛋白定量的特异性肽段Glc-VHLTPE及其对应的同位素标记肽段Glc-VH*LTPE。

3.根据权利要求2所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为，将合成的肽段水解成氨基酸，定量添加同位素标记氨基酸，以国家氨基酸标准物质为标准建立高效液相色谱-同位素稀释质谱方法测定水解液中稳定氨基酸含量，并据此计算特征肽段纯度；对于特异性肽段VHLTPE，用于定量的氨基酸为缬氨酸V、亮氨酸L和脯氨酸P；对于特异性肽段Glc-VHLTPE，用于定量的氨基酸为亮氨酸L和脯氨酸P。

4.根据权利要求3所述的高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为，取适量糖化血红蛋白溶解于pH＝4.0的醋酸铵缓冲液中，依据加入标准物质侯选物的量按照血红蛋白量:Glu-C量＝100:1的比例加入适量Glu-C，在60℃下孵育24小时进行酶切。