[发明专利]一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法

权利要求书

1.一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法，其特征在于，由以下四个部分组成：

(1)向载玻片上涂覆PDMS层，烘干后向PDMS层上滴加微球水分散液，加热，通过溶液挥发过程中的表面张力将微球有序的组装到PDMS基底上，形成点状光子晶体；所述微球为修饰有羧基的二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯微球；

(2)5’端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用T4 RNA ligase 2连接酶连接成环；连接条件为：2U T4 RNA ligase 2，39℃孵育90分钟；

(3)分支滚环扩增：以成环后的锁式探针作为模板、靶标miRNA作为引物，在Phi29 DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过引入二级引物，与线性滚环扩增产物互补配对，沿着支链方向扩增，达到信号扩增的目的；

(4)向滚环扩增产物中加入SYBR GREENⅠ染料，孵育后将其滴加到光子晶体上进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的5’端磷酸化的锁式探针的两端序列分别与靶标miRNA互补配对，且无二级结构；所述的二级引物能与线性滚环扩增的产物互补配对，但不与靶标miRNA完全互补配对。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微球为羧基修饰的聚苯乙烯微球。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将PDMS预混液旋涂于载玻片上，60～70℃恒温20-30小时，完全烘干，得到PDMS基底；将微球分散在水中，形成浑浊液，将浑浊液滴于PDMS基底上，恒温30～40℃，微球在PDMS基底上形成点状光子晶体；

(2)在连接体系中加入连接酶缓冲液、5’端磷酸化的锁式探针、待测样品、T4 RNAligase 2和水进行连接反应；

(3)向上一步体系中加入phi29 DNA聚合酶缓冲液、二级引物、phi29 DNA聚合酶、dNTPs和水进行滚环扩增反应，反应结束后对酶进行灭活；

(4)向上一步得到的滚环扩增产物中加入SYBR GREENⅠ染料，避光孵育后滴于点状光子晶体上，使用固体荧光定量仪器定量，荧光激发波长为488nm，发射波长为524nm；靶标miRNA存在的情况下荧光强度增强，且荧光强度随着miRNA浓度增强而增强。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中将浑浊液滴于PDMS基底上后恒温温度为40℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，滚环扩增反应的条件为30-37℃孵育1.5-3小时，灭活的条件为60-70℃灭活10-20分钟。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的避光孵育的条件为25-37℃避光孵育10-15分钟。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的固体荧光定量仪器为荧光光谱仪或活体成像仪。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的活体成像仪是用PE Spectrum。