[发明专利]一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法

说明书

本发明公开了一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法。该方法由四个部分组成：a.制备点状光子晶体；b.5’端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用T4RNA ligase 2连接成环；c.以成环的锁式探针作为模板，靶标miRNA作为引物，在phi29DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过加入二级引物，使线性滚环扩增沿着支链方向扩增，达到信号进一步放大；d.往滚环扩增产物中加入SYBR GREENⅠ染料后加到点状光子晶体上进行检测。本发明通过利用光子晶体效应对发光的调控，增强荧光强度，从而增强检测的灵敏度，降低检测下限，在最优实验条件下，该方法的线性范围为0.1aM‑1pM，miRNA的检测限低至1aM。本发明无需对循环miRNA进行分离提取，可直接用于实际样本中循环miRNA的检测。

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法。

背景技术

癌症早期诊断对于实现早发现早治疗的目的，从而提高癌症患者存活率是非常重要的。癌症早期诊断主要是针对于癌症标记物的检测，DNA、RNA、蛋白、小分子等都可以作为癌症标记物。其中，miRNA(微小RNA)转录后水平可调控基因表达而参与调控了一些生命活动，包括细胞增殖、分化、细胞凋亡等多种生理和病理过程。目前研究表明，血清和其他体液中的循环miRNA的表达水平与癌症的发展、治疗响应和病人的存活直接相关，因此，以循环miRNA作为癌症标记物的研究对于癌症早期诊断具有重大的意义。然而，血清中的循环miRNA的含量通常都极低，如何准确地检测血清中超痕量的循环miRNA一直以来都是困扰人们的重要问题。另一方面，传统的miRNA检测方法，如RT-PCR、微阵列、第二代测序多局限于实验室昂贵而精密的仪器、前处理复杂、耗时较长，无法实现临床应用中简单便携、灵活、经济的诊断要求。因此，为了实现癌症早期诊断的需要，开发一种即时、有效的可以实现多种循环miRNA的超痕量检测方法势在必行。

滚环扩增(RCA)是一种高效的等温酶促核酸扩增技术，该方法因具有操作简单、普适性强、特异性高、灵敏度高而被广泛地运用于DNA、RNA、蛋白的检测中。由于miRNA可以作为锁式探针链的连接模板，同时也可以作为等温扩增的引物这一巧妙设计而为miRNA的检测提供了新的检测途径。Li课题组提出超分支滚环扩增的方法，将微量检测物信号放大，从而提高了检测灵敏度，检出限可达到10fM。然而10fM的检出限还是没有达到超痕量的检测目的。

光子晶体是介质的周期排列而构成的一种人工微结构材料，具有光子带隙和周期性变化的折射率。近年来，由于光子晶体(PC)能够增强特定波长的光且能够实现在传播过程中最小损失的理想材料，而被广泛地运用于离子、DNA、蛋白等分子的低浓度检测中。最近有研究报道将光子晶体和荧光方法结合检测可卡因，可以将检出限降低到100aM。为了实现对miRNA的超痕量检测，设计一种运用光子晶体与滚环扩增双重增强的生物器件是一种理想的解决方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明通过光子晶体的分支滚环扩增的方法检测血清中的循环miRNA，该方法简单、用时短，且能够高灵敏地检测miRNA。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法，由以下四个部分组成：

一、向载玻片上涂覆PDMS层，烘干后向PDMS层上滴加微球分散液，加热，通过溶液挥发过程中的表面张力将微球有序的组装到PDMS基底上，形成点状光子晶体；所述微球为修饰或未修饰的二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯微球；

二、5’端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用T4RNA ligase2连接酶连接成环；