[发明专利]纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法，包括：步骤一、将纤维素酶产生菌的孢子置于湿室培养，直至孢子萌动至接近萌发的状态结束湿室培养；步骤二、采用液滴微流控技术将孢子、培养基以及纤维素酶标记底物包埋于液滴中，进行预培养，在孢子萌发产生的菌丝长度达到液滴边缘之前结束预培养；步骤三、检测液滴内的荧光，根据液滴内的荧光强度进行液滴微流控分选，筛选出荧光强度相对较高的一个或几个液滴；步骤四、对分选后的液滴中的孢子进行纯培养及复筛，以筛选出纤维素酶高产菌株。本发明筛选通量可以达到10⁴个突变体/天。采用本发明的高通量筛选方法，得到了若干株酶活提高的突变体，其中最高突变株纤维素酶活提高达42％。

技术领域

本发明属于微生物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法。

背景技术

丝状真菌具有高效的蛋白分泌的能力，作为一种重要的工业酶生产来源在各个行业有广泛的应用。丝状真菌在亿万年的进化过程中逐渐进化出多种胞外水解酶系，如淀粉酶，纤维素酶和蛋白酶等。此外，丝状真菌由于其代谢多样性，可以用于多种有机酸和其他药物合成中间体的生产。因此如何提高菌株的生产性能在工业生产中是至关重要的。近年来，虽然随着基因工程技术和组学工具的发展，在丝状真菌菌株的定向改造上取得了很大的进展，但是由于缺乏高效、快速的筛选方法，丝状真菌菌株在提高菌株生产能力和新酶发现上受到很大程度的限制。

微流控技术最近在各行各业受到较多关注，在微生物包括分子生物学领域，其最主要的优势就在于能够分别对每一个特定液滴进行分析，其速度快、体积小，能够创造独立内环境的特性，已经应用于细胞和酶的定向进化、遗传物质的分析等方面。这些应用都涉及到将每个独立反应所需的细胞及相关试剂包裹到单个液滴中。分选系统特有的功能单元又使得液滴的鉴别分离操作成为可能。但目前还没有将微流控技术应用于纤维素酶高产菌株的筛选的报道。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法，包括：

步骤一、将纤维素酶产生菌的孢子置于湿室培养，直至孢子萌动至接近萌发的状态结束湿室培养；

步骤二、采用液滴微流控技术将所述步骤一培养的孢子、培养基以及纤维素酶标记底物包埋于液滴中，进行预培养，在孢子萌发产生的菌丝长度达到液滴边缘之前结束预培养；

步骤三、检测液滴内的荧光，根据液滴内的荧光强度进行液滴微流控分选，筛选出荧光强度相对较高的一个或几个液滴；

步骤四、对分选后的液滴中的孢子进行纯培养及复筛，以筛选出纤维素酶高产菌株。

优选的是，所述的纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法中，所述步骤二中，所述培养基由以下质量百分比的组分组成：微量元素0.1％，多聚蛋白胨0.1％，MgSO₄ 0.06％，乳糖0.1％-0.2％，pH 4.8-5.5；所述预培养的温度为30℃；所述预培养持续的时间为12h。

优选的是，所述的纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法中，所述培养基中乳糖的质量百分比为0.2％。

优选的是，所述的纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法中，所述湿室培养的持续时间为6-7h，所述湿室培养的温度为30℃。

优选的是，所述的纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法中，所述预培养的持续时间通过以下过程测定：

采用液滴微流控技术将所述步骤一培养的孢子和培养基包埋于液滴中，进行测定阶段的培养，观察孢子在液滴中的萌发情况，确定孢子萌发产生的菌丝长度达到液滴边缘的时间，所述预培养的持续时间短于所述孢子萌发产生的菌丝长度达到液滴边缘的时间。