[发明专利]一种用于病毒包装的293T细胞株的构建方法

说明书

本发明公开了一种用于病毒包装的293T细胞株的构建方法，包括如下步骤：步骤一：合成靶向EIF2AK2基因的sgRNA克隆质粒；步骤二：EIF2AK2‑sgRNA‑CAS9质粒转染293T细胞；步骤三：通过嘌呤霉素筛选获得EIF2AK2基因敲除的单克隆细胞株；步骤四：病毒包装。本发明通过该方法获得的293T细胞(EIF2AK2‑KO)，在转染相同量的病毒包装质粒时，生产的病毒量要高于未做处理的293T细胞(EIF2AK2‑CON)。即，在293T细胞中通过去除EIF2AK2基因的表达，能够提高病毒的生产量，降低病毒的生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于病毒包装的293T细胞株的构建方法。

背景技术

293T细胞由HEK293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区，293T细胞广泛应用于病毒包装。用磷酸钙转染效率可高达50％。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。

Crispr/Cas9技术，是近年来出现的高效的基因组定点编辑技术，通过人工设计成具有引导作用的sgRNA(small guide RNA)靶向于目的基因，引导核酸酶Cas9蛋白对DNA定点切割，致使目的基因不能正常表达。在使用该技术时需要先对目的基因的基因组进行分析，在该基因的外显子区域寻找Cas9酶的作用的识别位点NGG，其中N可以是A、T、C、G中的任意一种，实验中根据作用位点前20个碱基设计合成sgRNA的序列正义链和反义链。两条单链退火成双链后构建至sgRNA-Cas9克隆载体，进行质粒转染细胞或者包装成病毒感染细胞，在细胞内靶向目的基因对其进行切割，使得该基因失活，从而达到基因敲除的目的。

EIF2AK2(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 2)，又名：PKR，真核生物的蛋白翻译起始是一个复杂的细胞活动进程，它需要一系列的蛋白参与，这些蛋白就被称为真核翻译起始因子(eukaryotic initiation factor，简称为eIF)，目前已经发现了至少12种不同的起始因子。该基因表达的蛋白被磷酸化激活后，可以抑制病毒蛋白不能合成，具有抗病毒作用。因此，在病毒包装的工具细胞中将该基因进行敲除，将可以提高病毒的产毒效率。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种用于病毒包装的293T细胞株的构建方法，通过该方法获得的293T细胞(EIF2AK2-KO)，在转染相同量的病毒包装质粒时，生产的病毒量要高于未做处理的293T细胞(EIF2AK2-CON)。即，在293T细胞中通过去除EIF2AK2基因的表达，能够提高病毒的生产量，降低病毒的生产成本。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种用于病毒包装的293T细胞株的构建方法，包括如下步骤：

步骤一：合成靶向EIF2AK2基因的sgRNA克隆质粒；

步骤二：EIF2AK2-sgRNA-CAS9质粒转染293T细胞；

步骤三：通过嘌呤霉素筛选获得EIF2AK2基因敲除的单克隆细胞株；

步骤四：病毒包装。

进一步地说，用所述EIF2AK2基因设计用于Cas9作用的靶点序列为①TAATACATACCGTCAGAAGCAGG；②ATTCAGGACCTCCACATGATAGG；③AATACATACCGTCAGAAGCAGGG。

更进一步地说，根据靶点序列设计复合载体克隆位点需求的oligo，序列信息如下：

①EIF2AK2-sgRNA-oligo-1F:CACCGTAATACATACCGTCAGAAGC；