[发明专利]一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA

权利要求书

1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白OmpA在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述亚单位疫苗的制备方法如下：

（1）以迟缓爱德华菌ET-1基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增ompA基因；其中引物P1和P2为：

P1：5’-ATGAAAAAAACAGCGATCGCA-3’ SEQ ID NO：1；

P2：5’-TTAAGCCTGCGGCTGAGAAACTTC-3’ SEQ ID NO：2；

（2）构建pMD18-T-ompA载体，对ompA基因进行序列测定；

（3）测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，以pMD18-T-ompA为模板，P3和P4为引物，PCR扩增ompA基因，获得纯化目的基因；其中引物P3和P4为：

P3：5’-GGAATTCGCTCCGAAAGATAACACCTGG-3’，EcoRⅠ；SEQ ID NO：3；

P4：5’-ACGCGTCGACAGCCTGCGGCTGAGTAACTTC-3’，SalⅠ；SEQ ID NO：4；

（4）利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对纯化目的基因和pET-32a载体分别进行双酶切，构建重组表达载体pET-32a-ompA；

（5）将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；

（6）将重组表达载体pET-32a-ompA和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌，进行重组蛋白的原核表达；

（7）利用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况；

（8）对重组蛋白进行Western blot验证；

（9）利用尿素提取法对包涵体进行纯化，将超声裂解后的沉淀物按每克溶于1mL水中，4℃高速离心15min；将沉淀重悬于1mL含有1M尿素的0.1mol/L pH8.5的Tris-Cl，4℃高速离心15min；取上清获得较为纯净的目的蛋白OmpA；

（10）将步骤（9）获得的目的蛋白OmpA用弗氏完全佐剂乳化，获得亚单位疫苗；

步骤（6）所述转化BL21工程菌的具体步骤如下：分别将5μL重组载体pET-32a-ompA和5μL空载体pET-32a加入到100μL BL21工程菌中；冰浴30min，42℃热浴90s，冰浴5min；加入1mL液体LB培养基，37℃复壮1h后，各取5μL涂布于氨苄终浓度为100μg/mL的固体LB平板，倒置，37℃培养过夜。

2.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白OmpA在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤（1）所述PCR扩增的反应体系为20μL，其中2×Taq PCRMix 10μL，20μM P1 1μL，20μM P2 1μL，模板1μL，ddH₂O 7μL，PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，25个循环，72℃ 10min。

3.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白OmpA在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤（3）所述PCR扩增的反应体系为20μL，其中2×Taq PCRMix 10μL，20μM P3 1μL，20μM P4 1μL，模板1μL，ddH₂O 7μL，PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 60s，30个循环，72℃ 10min。

4.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白OmpA在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤（8）所述Western blot验证以His-Mab为一抗、HRP-IgG为二抗。