[发明专利]一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA

说明书

本发明公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA在亚单位疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，具体包括：以迟缓爱德华菌ET‑CL基因组序列为模板，PCR扩增ompA基因；构建pMD18‑T‑ompA载体，对ompA基因进行序列测定；构建重组表达载体pET‑32a‑ompA；将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆，提取质粒，测序；进行重组蛋白的原核表达；利用SDS‑PAGE分析重组蛋白表达情况；对重组蛋白进行Western blot验证。本发明利用原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的重组蛋白，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，表明该重组蛋白能够用于研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA。

背景技术

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda，E.tarda)是水产养殖中十分常见的病原细菌之一，能够引起多种海水和淡水鱼类感染发病，造成高死亡率、系统感染和败血症，鱼群整体免疫力下降，严重影响水产养殖发展。目前，E.tarda已经成为我国鲽、鲆、鳗鱼类的最重要病原之一，给水产养殖造成重大损失。除此之外，E.tarda可以引起人的多种类型感染，严重可致败血症，危及生命，因此对本菌的研究具有重要的公共卫生学意义。

畜禽养殖上疫苗广泛使用对疫病的防控效果良好，为水产疫病防控提供了借鉴。对于E.tarda而言，基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究成为研究的热点。研究表明，外膜蛋白(outermembrane proteins，Omps)具有优良的免疫原性，能够诱导机体产生非常强的免疫反应，利用外膜蛋白粗提物免疫动物展现出非常好的保护效果。本发明利用原核表达系统对外膜蛋白主要成分OmpA(outer-membrane proteinA)进行表达和纯化，通过动物实验评估该重组蛋白对于模型动物的保护力，表明该重组蛋白能够用于研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA，具体通过原核表达方法，获得迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA重组蛋白，从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA在亚单位疫苗中的应用。

进一步，所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的制备方法，具体步骤如下：

(1)以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增ompA基因；PCR扩增的反应体系为20μL，其中2×Taq PCR Mix 10μL，引物P1(20μM)和P2(20μM)各1μL，模板1μL，ddH₂O 7μL，PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃60s，25个循环，72℃10min；其中引物P1和P2为：

P1：5’-ATGAAAAAAACAGCGATCGCA-3’；SEQ ID NO：1；

P2：5’-TTAAGCCTGCGGCTGAGAAACTTC-3’；SEQ ID NO：2；

(2)构建pMD18-T-ompA载体，对ompA基因进行序列测定；