[发明专利]一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ

权利要求书

1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述亚单位疫苗的制备方法如下：

（1）以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增flgJ基因；其中引物P1和P2为：

P1：5’-gGAATTCATGGCCGACGATAGCCTGGCGTTTA-3’，EcoRI；SEQ ID NO：l；

P2：5’-gcGTCGACCTAAAACAGATTCGCCAAATCGTGG-3’，SalI；SEQ ID NO：2；

（2）构建pMD18-T-flgJ载体，对flgJ基因进行序列测定；

（3）利用限制性内切酶EcoRI和SalI对pMD18-T-flgJ载体和pET-32a载体分别进行双酶切，构建重组表达载体pET-32a-flgJ；

（4）将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；

（5）将重组表达载体pET-32a-flgJ和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌，进行重组蛋白的原核表达；

（6）利用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况；

（7）对重组蛋白进行Western blot验证；

（8）利用尿素提取包涵体法对菌体裂解物进行纯化，将超声裂解后的沉淀物按每克溶于1mL水中，4℃高速离心15min；将沉淀重悬于1mL含有1M尿素的0.1mol/L pH8.5的Tris-Cl，4℃高速离心15min；取上清获得较为纯净的目的蛋白FlgJ；

（9）将步骤（8）获得的目的蛋白FlgJ用白油乳化，获得亚单位疫苗；

步骤（5）所述转化BL21工程菌的具体步骤如下：分别将5μL重组载体pET-32a-flgJ和5μL空载体pET-32a加入到100μL BL21工程菌中；冰浴30min，42℃热击90s，冰浴5min；加入1mL液体LB培养基，37℃复壮1h后，各取5μL涂布于氨芐终浓度为100μg/mL的固体LB平板，倒置，37℃培养过夜。

2.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤（1）所述PCR扩增的反应体系为2×Taq PCR Mix 10μL，20μM P1 1μL，20μM P2 1μL，模板1μL，ddH₂O 7μL，共20μL；PCR扩增反应程序为94℃预变性5min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，25个循环，72℃10min。

3.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，步骤（7）所述Western blot验证以His-Mab为一抗、HRP-IgG为二抗。