[发明专利]一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ

说明书

本发明公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在亚单位疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，具体包括：以迟缓爱德华菌ET‑CL基因组序列为模板，PCR扩增flgJ基因；构建pMD18‑T‑flgJ载体，对flgJ基因进行序列测定；构建重组表达载体pET‑32a‑flgJ；将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；转化BL21工程菌，进行重组蛋白的原核表达；利用SDS‑PAGE分析重组蛋白表达情况；对重组蛋白进行Western blot验证。本发明通过原核表达系统对迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ进行表达纯化，通过动物实验证明该重组蛋白具有免疫保护力，表明该重组蛋白能够用于研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ。

背景技术

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda，E.tarda)在水产养殖中十分普遍，危害巨大。目前生产上针对迟缓爱德华菌感染主要通过抗生素和化学药物进行应对，但由此造成的水体污染和菌株耐药情况，不容乐观，特别是多重耐药菌株的不断出现给该病防控带来严峻挑战。此外，E.tarda人兽共患，且近年来人感染病例逐年增加，揭示其重要的公共卫生学意义。

目前国内已有针对迟缓爱德华菌病的灭活疫苗和弱毒疫苗获批生产，其中灭活疫苗免疫效果差强人意，弱毒疫苗设计专为大菱鲆使用，远远无法满足多元化水产养殖的需求。开发高效的、满足不同动物使用的迟缓爱德华菌疫苗仍在研究当中，基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究是一个重要方向。研究发现，细菌鞭毛蛋白具有优良的免疫原性，同时能够促进吞噬细胞的吞噬作用起到免疫增强作用，具有一定的应用前景。

基于此，本发明通过原核表达系统对迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ进行表达纯化，通过动物实验证明该重组蛋白具有免疫保护力，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ，具体通过原核表达方法，获得迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的重组蛋白，从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ在亚单位疫苗中的应用。

进一步，所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FlgJ的制备方法，具体步骤如下：

(1)以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增flgJ基因；PCR扩增的反应体系为2×TaqPCR Mix 10μL，引物P1(20μM)和P2(20μM)各1μL，模板1μL，ddH₂O 7μL，共20μL；PCR扩增反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃60s，25个循环，72℃10min；其中引物P1和P2为：

P1：5’-gGAATTCATGGCCGACGATAGCCTGGCGTTTA-3’，EcoR I；SEQ ID NO：1；

P2：5’-gcGTCGACCTAAAACAGATTCGCCAAATCGTGG-3’，Sal I；SEQ ID NO：2。

其中，小写字母为保护碱基，下划线部分为酶切位点；

(2)构建pMD18-T-flgJ载体，对flgJ基因进行序列测定；

(3)利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-flgJ载体和pET-32a载体分别进行双酶切，构建重组表达载体pET-32a-flgJ；