[发明专利]坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白的表达方法及其产品和应用

说明书

本发明涉及一种坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白的表达方法及其产品和应用，通过将非结构蛋白NS2A截短，然后进行重组表达，截短后容易表达，且表达量高；表达中通过优化表达条件使重组蛋白在包涵体内表达，便于纯化，纯化的蛋白具有免疫原性，免疫动物后能够获得效价高的多抗血清，并且制得的抗体灵敏度高，可用于坦布苏病毒非结构蛋白NS2A的检测以及并检测坦布苏病毒在感染不同时期非结构蛋白NS2A在细胞内的定位变化情况，对坦布苏病毒的研究具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白的表达方法，还涉及表达的截短蛋白和在制备多克隆抗体中的应用。

背景技术

坦布苏病毒病(Tembusu virus disease)是由坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)引起的急性传染病，坦布苏病毒是属于黄病毒科黄病毒属的病毒，主要感染水禽，引起出血性卵巢炎和神经症状，临床症状主要为食欲下降或废绝，体重急剧下降和产蛋量下降。随着我国养禽业规模的不断扩大，坦布苏病毒作为威胁我国养禽业的主要病毒之一，引起了巨大的经济损失。但目前还没有适合的用于治疗坦布苏病毒感染的特效药和治疗方案。

坦布苏病毒非结构蛋白NS2A在病毒的基因的复制和病毒的装配中有重要的作用，但到目前为止，有关非结构蛋白NS2A的功能及定位情况还没有详细的研究，而使用标签抗体不管是在研究定位或其功能都有很大的局限，而全长NS2A蛋白是一个拥有八个跨膜区的跨膜蛋白且含有很多稀有密码子，因此我们提供了一种截短方案便于蛋白的表达，同时制备的抗体能够高特异性及高灵敏度的识别全长的NS2A蛋白，NS2A的多克隆抗体在检测DTMUV感染时NS2A的定位情况有重要的作用。

因此，急需一种容易表达且具有免疫原性的NS2A截短片段，对坦布苏病毒的预防和治疗具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白的表达方法；本发明的目的之二在于提供由所述的表达方法获得的坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白；本发明的目的之三在于提供所述坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白在制备抗坦布苏病毒非结构蛋白NS2A多克隆抗体中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白制得的抗坦布苏病毒非结构蛋白NS2A多克隆抗体；本发明的目的之五在于提供所述抗坦布苏病毒非结构蛋白NS2A多克隆抗体在检测坦布苏病毒感染中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白的表达方法，具体步骤如下：

1)以感染坦布苏病毒的鸭胚成纤维细胞提取的RNA为模板，反转录合成cDNA，然后以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增，扩增获得NS2A截短基因；

2)将步骤1)扩增获得的NS2A截短基因连入表达载体获得重组表达载体，然后将重组表达载体转化宿主表达菌，获得工程菌，然后将工程菌用IPTG诱导表达，经纯化获得坦布苏病毒非结构蛋白NS2A截短蛋白。

优选的，步骤2)中，所述表达载体为pGEX-4T-1质粒。

优选的，步骤2)中，所述宿主表达菌为BL21(DE3)。

优选的，步骤2)中，所述诱导表达为将工程菌培养至A600＝0.6时，按终浓度为0.4～0.5mM加入IPTG，诱导表达6～8小时。

优选的，所述纯化为取诱导表达菌液，离心收集菌体，然后加入相当于菌液体积1/10的浓度为20mM、pH为8的Tris-HCl重悬菌体，取重悬菌液，加入相当于重悬菌液体积1/5的6×loading buffer，100℃水浴加热变性10分钟后用12％的SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后用0.25mMol/L的KCL溶液显色，切胶回收目的片段，利用透析袋获得坦布苏病毒NS2A截短蛋白。