[发明专利]去细胞甲床的制备方法以及组织工程化甲床的构建方法

权利要求书

1.一种去细胞甲床的制备方法，其特征在于，该制备方法至少包括以下依次进行的步骤：

步骤1），取甲床组织：在无菌条件下获取截指患者的甲床组织，且保留甲床根部；

步骤2），通过震荡处理去除细胞：将步骤1）获取的甲床组织放置于摇床振荡器上进行振荡，并且将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡40分钟~1.5小时、1%的Triton X-100溶液中振荡3.5小时~4.5小时、PBS溶液中振荡40分钟~1.5小时、0.8%SDS溶液中振荡3.5小时~4.5小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡3.5小时~4.5小时获得去细胞甲床；其中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为800~1200U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有80~120U/L青霉素、0.08~0.12 mg/mL链霉素以及0.08~0.12 mg/mL两性霉素B的PBS溶液；其中，振荡的速度为100~150转/分钟；

步骤3）干燥处理：将步骤2）获得的去细胞甲床真空干燥处理至少6小时，再通过60Co-γ射线灭菌处理至少2小时，其中60Co-γ射线的辐射强度为10~15krad。

2.如权利要求1所述的去细胞甲床的制备方法，其特征在于：

在所述步骤3）中，将所述灭菌处理完成后得到的去细胞甲床密封保存于-80摄氏度环境中。

3.如权利要求1或2所述的去细胞甲床的制备方法，其特征在于：

在所述步骤2）中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为1000 U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有100 U/L青霉素、0.1 mg/mL链霉素以及0.1 mg/mL两性霉素B的PBS溶液。

4.如权利要求3所述的去细胞甲床的制备方法，其特征在于：

在所述步骤2）中，将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡1小时、1%的Triton X-100溶液中振荡4小时、PBS溶液中振荡1小时、0.8%SDS溶液中振荡4小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡4小时获得去细胞甲床；其中，振荡的速度为128转/分钟。

5.一种组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：该构建方法至少包括以下依次进行的步骤：

步骤a）灭菌处理：将所述权利要求1或2得到的去细胞甲床浸泡于青链霉素双抗溶液中进行灭菌处理至少12小时，然后再用PBS溶液清洗所述青链霉素双抗溶液；其中，所述青链霉素双抗溶液中含有80-120 U/L青霉素和0.08-0.12mg/mL链霉素；

步骤b）去细胞甲床的孵育：将步骤a）处理后获得的去细胞甲床置于含有10%体积比的胎牛血清的DMEM低糖培养基中孵育至少2小时；

步骤c）接种：将甲床干细胞按1.5×10⁶~2.5×10⁶个/平方厘米的密度接种到步骤b）获得的去细胞甲床上；

步骤d）甲床干细胞的培养：在37℃、5%CO₂的环境下，在所述含有10%体积比的胎牛血清的DMEM低糖培养基的存在下培养至少7天，隔天换液，获得所述组织工程化甲床。

6.如权利要求5所述的组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：

在所述的步骤c）中，将甲床干细胞按照2×10⁶个/平方厘米的密度接种到步骤b）获得的去细胞甲床上。

7.如权利要求5所述的组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：

在所述去细胞甲床的制备方法的步骤2）中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为1000 U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有100 U/L青霉素、0.1 mg/mL链霉素以及0.1 mg/mL两性霉素B的PBS溶液。

8.如权利要求7所述的组织工程化甲床的构建方法，其特征在于：

在所述去细胞甲床的制备方法的步骤2）中，将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡1小时、1%的Triton X-100溶液中振荡4小时、PBS溶液中振荡1小时、0.8%SDS溶液中振荡4小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡4小时获得去细胞甲床；其中，振荡的速度为128转/分钟。