[发明专利]去细胞甲床的制备方法以及组织工程化甲床的构建方法

说明书

本发明涉及一种去细胞甲床的制备以及基于该去细胞甲床的组织工程化甲床的构建方法，其中采用脱细胞技术来制备去细胞甲床，该去细胞甲床无细胞及核酸成分，细胞外基质的结构及活性成分保存良好，生物相容性极佳；再基于该去细胞甲床来体外接种人源性的甲床干细胞，构建组织工程化甲床；构建的组织工程化甲床具备与正常甲床一致的组织结构和组成成分，并且接种的甲床干细胞具有特定的分化潜能，该组织工程化甲床具有一定程度的生长指甲的能力，可实现甲床缺损的修复，具有极佳的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种去细胞甲床的制备方法以及组织工程化甲床的构建方法，属于甲床治疗领域。

背景技术

指甲作为皮肤的附属结构，具有保护指端、辅助指端捏持、增强指腹感觉的作用，并可辅助手指完成一些日常生活中的特殊动作；同时指甲也是人体美容的重要修饰部分。

按照传统的手功能损害评定标准，指甲缺损并不造成手功能的丧失，但随着人们生活水平的日益提高及社交活动的增加，越来越多的患者要求修复指甲缺损，因此甲床缺损的修复显得尤为重要。

目前，临床上治疗甲床缺损，通常是施行植皮术、皮瓣修复术、甲床移植术及拇甲瓣移植术。这些手术的结果，多为新生的指甲不美观、不能生长指甲，或是以牺牲另外的指甲或趾甲为代价，例如，植皮术和皮瓣修复术是取甲床缺损患者自体的局部真皮或皮瓣进行移植，修复缺损甲床；虽然修复了缺损的甲床，但并不能替代甲床的功能，无指甲的新生；例如，甲床移植术，通过取较少暴露的足趾甲床移植到缺损区，然而该术式需要牺牲正常甲床，修复的甲床存活率较低，且长出的新指甲可能存在异常的外观，因此该术式在临床的使用率较低；例如，拇甲瓣移植术，主要适用于手拇指软组织缺损，常采用足趾的拇甲瓣修复手指软组织缺损；该术式修复的手指甲床保存良好，带指甲，然而常常会牺牲足趾的甲床。

因此，如何满意地修复甲床缺损以形成满意的指甲，是手外科临床上未能解决的难题之一。

2007年有国内学者尝试将甲床上皮细胞接种到脱细胞真皮基质上，然而构建的这种类甲床替代物并未进行动物模型体内移植，因此，其实际应用效果并未可知。

因此，发明人希望研究出一种新的组织工程化甲床的制备方法，获得的组织工程化甲床的组织结构与正常甲床一致，可实现甲床缺损的修复，而且无免疫排斥反应。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种去细胞甲床的制备方法，该制备方法至少包括以下依次进行的步骤：

步骤1)，取甲床组织：在无菌条件下获取患者的甲床组织，且保留甲床根部；

步骤2)，通过震荡处理去除细胞：将步骤1)获取的甲床组织放置于摇床振荡器上进行振荡，并且将甲床组织依次浸泡于肝素PBS溶液中振荡40分钟～1.5小时、1％的TritonX-100溶液中振荡3.5小时～4.5小时、PBS溶液中振荡40分钟～1.5小时、0.8％SDS溶液中振荡3.5小时～4.5小时、含有三种抗体的PBS溶液中振荡3.5小时～4.5小时获得去细胞甲床；其中，所述肝素PBS溶液是指肝素浓度为800～1200U/L的PBS溶液，所述含有三种抗体的PBS溶液是指含有80～120U/L青霉素、0.08～0.12mg/ml链霉素以及0.08～0.12mg/ml两性霉素B的PBS溶液；其中，振荡的速度为100～150转/分钟；

步骤3)干燥处理：将步骤2)获得的去细胞甲床真空干燥处理至少6小时，再通过60Co-γ射线灭菌处理至少2小时，其中60Co-γ射线的辐射强度为10～15Krad。

在本发明的一个优选实施方案中，在所述步骤3)中，将所述灭菌处理完成后得到的去细胞甲床密封保存于-80摄氏度环境中。