[发明专利]柳杉二醇合成酶、其编码基因及在生物合成上的应用

说明书

本发明涉及一种柳杉二醇合成酶及其编码基因，以及柳杉二醇合成酶及编码基因在植物育种及生物合成中的运用，通过聚合酶链式反应首次克隆得到了雷公藤中新型柳杉二醇合成酶基因的cDNA全长序列，然后利用合成生物学手段，构建了包含本发明所述柳杉醇合成酶基因的酵母工程菌，实现酵母中生产柳杉二醇。

技术领域

本发明涉及一种柳杉二醇合成酶及其编码基因，以及柳杉二醇合成酶及编码基因在植物育种及生物合成中的运用，属于药用成分合成生物学领域。

通过聚合酶链式反应首次克隆得到了雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.F.)中新型柳杉二醇合成酶基因(TwCS)的cDNA全长序列，然后利用合成生物学手段，构建酵母工程菌，在酵母中生产柳杉二醇。

背景技术

倍半萜类化合物是一类天然化合物，具有多种生理和生态功能，如抗微生物，防御昆虫和草食动物等。目前，在高等植物和低等植物中都发现了大量的倍半萜类化合物，广泛用于工农业和医药领域。倍半萜的生物合成仅来自简单的C5异戊二烯结构单元，异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)。三分子的C5单元在异戊烯基转移酶参与下，发生级联反应，碳链延伸，生成含有15个碳原子的焦磷酸法呢酯(arnesyl pyrophosphate，FPP)，FPP既而可在倍半萜合酶催化下，环化生成结构多样的倍半萜化合物。

柳杉二醇首先在Cryptomeria japonica植物中被发现，随后在多种植物的挥发油中均有微量的柳杉二醇被检出。柳杉二醇具有一定的解痉作用，是抗痉挛药物的活性成08鉴于柳杉二醇在植物中含量较低且分离困难，一些研究者设计了其化学合成和半合成的路线，如通过金属离子催化的氧化反应，可以将(-)-elemol历经多步反应合成柳杉二醇。此外，还可以茴香酸(ilicic acid)为起始原料，采用相对简单高效的半合成工艺，经三步反应获得柳杉二醇。

然而，使用多步合成步骤相较植物体内，柳杉二醇合成途径的酶而言，是较为繁琐的。目前，通过细胞工厂的微生物发酵在单体化合物的工业生产方面具有高度竞争力。将基因元件(启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等)依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。通过对已有生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，表达出天然细胞不能合成或含量极低的产物。如利用完整的青蒿酸生物合成途径在酵母工程菌中生产抗疟药青蒿素，每升发酵液可生产青蒿酸25克。

发明内容

本发明一方面提供了一种柳杉二醇合成酶，所述合成酶具有如下氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的蛋白。

本发明的另一方面提供了一种编码本发明所述柳杉二醇合成酶的基因(Tripterygium wilfordii Cryptomeridiol Synthase,TwCS)：所述基因，它是下列核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID NO：1第所示的核苷酸分子；或

(2)SEQ ID NO：1第所示的核苷酸分子经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；或

(3)在严谨条件下与SEQ ID NO：1所示核苷酸分子杂交的核苷酸序列，所述严谨条件为：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％的SDS的0.1×SSC溶液中杂交。