[发明专利]一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用

说明书

本发明提供了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用，所述制备方法包括以下步骤：A、扩增RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，得质粒；C、将步骤B得到的质粒转化感受态细胞，得重组质粒；D、将步骤C得到的重组质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。本发明成功构建了表达兔病毒性出血症Ⅱ型衣壳蛋白的杆状病毒，并使其在昆虫细胞上成功表达，最终通过蛋白电泳，免疫印迹、电镜观察进行了病毒表达产物的鉴定。该杆状病毒在未来可以用来进行新型兔病毒性出血症亚单位疫苗的研究，以此用来预防兔病毒性出血症Ⅱ型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用。

背景技术

兔病毒性出血症病毒Ⅱ型(RHDV2)又称为新型兔瘟，是一种新发的、目前已广泛流行于欧洲、澳大利亚的动物传染病。该病毒可引起免疫过经典兔瘟疫苗的兔患病，同时还能感染野兔，致病率高，并且该病毒能够感染经典兔病毒性出血症病毒不能感染的小于四十日龄的幼龄家兔，其引起的主要临床症状包括急性肝坏死，气管出血，肺脏出血，肝脏出血以及坏死等，同时临床中多伴有脾脏肾脏肿大。目前该病毒在澳大利亚已经有取代经典兔瘟的趋势，而在欧洲该病毒也严重影响了养兔业发展，严重危害着野生动物的安全。在已爆发新型兔瘟的国家，例如荷兰，法国、意大利、波兰等，其仍采用经典的灭活疫苗法来防治新型兔瘟，但是传统的灭活疫苗其在灭活过程中有可能损害或改变有效的抗原决定簇，产生的免疫效果以及维持时间相对较短，而且需要多次注射灭活疫苗，对抗原量的需求比较大，成本相对而言也比较高；也可能产生毒性或存在潜在的对机体不利的免疫反应，与此同时灭活苗在一定程度上也存在散播强毒的潜在危险，最重要的是在灭活疫苗的制备过程中也必须使用RHDV2感染致死的兔内脏组织为原料，而如今在国内尚未有关于新型兔瘟病毒的报道，其是否由于检测手段的不完善性导致的也不得而知。RHDV2的衣壳蛋白是RHDV2的主要结构蛋白，由该病毒的VP60基因编码，该蛋白并且能够自我组装成为病毒样颗粒，病毒样颗粒不含有病毒的核酸，可以模拟病原刺激机体产生免疫保护效应，而且利用杆状病毒表达系统表达的衣壳蛋白，具有翻译后修饰功能，使得重组的蛋白在结构和功能上与天然蛋白更接近。

目前利用杆状病毒表达系统生产制备的疫苗已广泛使用于各类疾病的预防，例如乙型肝炎和人乳头瘤病毒等等。鉴于RHDV2可能对我国养兔业带来巨大的经济损失，制备该病毒的亚单位疫苗以及日后研究该病毒的检测方法对于我国养兔业具有重要的意义，也为我们未来继续研究RHDV如何演化成为RHDV2提供一定的研究基础。而目前尚未有采用杆状病毒表达RHDV2衣壳蛋白的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用。

本发明参照NCBI公布的兔病毒性出血症病毒Ⅱ型RHDV2的衣壳蛋白(VP60)编码基因开放阅读框，设计了一对含有特异性酶切位点的引物，扩增RHDV2的衣壳蛋白编码基因，将扩增的基因克隆于昆虫杆状病毒表达载PFAST-BAC-HTA中。

本发明涉及兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白基因重组杆状病毒的制备研究，通过扩增兔病毒性出血症病毒Ⅱ型的衣壳蛋白VP60全长片段，通过分子生物学技术构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，获得能够表达衣壳蛋白的杆状病毒，然后将该病毒的表达产物通过相关技术手段进行了鉴定，本发明提供了一种可以成功表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白的方法，表达的衣壳蛋白可以自我包装成病毒样颗粒(virus likeparticles)，在未来可以用来进行新型兔病毒性出血症亚单位疫苗的研究，以此用来预防兔病毒性出血症Ⅱ型。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：

A、扩增RHDV2的VP60基因；