[发明专利]小麦黄条纹病毒及其NASH检测方法、检测试剂盒

权利要求书

1.小麦黄条纹病毒（Wheat yellow striate virus, WYSV）基因组序列，该序列如SEQID NO.3所示。

2.一种用于权利要求1所述小麦黄条纹病毒（Wheat yellow striate virus, WYSV）的核酸斑点杂交检测方法，包括如下步骤：

（1）重组质粒的获得：所述的重组质粒是含WYSV部分基因目的片段的pMD -18T重组载体；所述的重组载体是通过WYSV特异性引物对以反转录PCR扩增获得的PCR产物，纯化后连接至pMD -18T载体上，转化至DH 5α大肠杆菌感受态中；所述WYSV特异性引物对为：

SEQ ID NO.1：5’ ggtgctcagtgtcgctttct -3’；

SEQ ID NO.2：5’ acctgctgttccattcttgtc -3；

（2）地高辛标记探针的制备：所述探针为以地高辛为标记物通过PCR法制得的DNA探针，所述制备探针的PCR体系中总体积25 μL，其中0.5 μL重组质粒、2 μL浓度为2.5 mM的DIG-dNTPs、0.2 μL rTaq以及浓度为10 μmol/L的WYSV特异性引物对各0.5μL，

在制备探针的PCR体系反应液中，包含有如下一对特异性引物对，其核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5’ ggtgctcagtgtcgctttct -3’；

SEQ ID NO.2：5’ acctgctgttccattcttgtc -3’；

（3）通过点样和杂交进行NASH检测：

将待测总RNA样品点于硝酸纤维素尼龙膜上，加入杂交缓冲液进行预杂交；将步骤（2）中制备的地高辛标记探针加入杂交缓冲液中杂交，再免疫显色。

3.根据权利要求2所述的检测方法，所述步骤（1）中PCR扩增反应条件为：94℃ 3 min，94℃ 30 s、56℃ 45 s 和72℃90 s共35 个循环，72℃ 10 min。

4.权利要求2－3任一所述的检测方法在检测感病农作物植株体内WYSV病毒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述农作物为小麦，大麦或燕麦。

6.一种用于检测 WYSV病毒的试剂盒，该试剂盒包括有： PCR体系反应液、NASH反应试剂、硝酸纤维素膜和杂交袋；所述的NASH反应试剂由以下组分组成：

SDS： 10%w/v

封闭液： 封闭剂用Buffer1稀释到10%

洗涤液： Buffer1+0.3%w/v Tween-20

Buffer 1: 0.1M Maleic acid，0.15M NaCl，pH7.5

Buffer 2: 将封闭液用Buffer 1稀释10倍

Buffer 3: 100mMTris-HCl，100mMNaCl，pH9.5

Buffer 4: 10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0

NBI/CBIP: 10mL

显色底物溶液: 200μL NBT/BCIP加入10mL Buffer3中

杂交缓冲液： 5×SSC，2%w/v封闭液，0.02%w/v SDS, 0.1%w/v N-lauroylsarcosine, 50%甲酰胺

AP-DIG抗体: 50μL

20×SSC溶液： 3MNaCl，0.3M Na-citrate, pH7.0，实验中所需的0.5×SSC、2×SSC、5×SSC溶液由20×SSC做相应稀释；

所述PCR体系反应液中含WYSV特异性引物对，其序列如下：

SEQ ID NO.1：5’ ggtgctcagtgtcgctttct -3’；

SEQ ID NO.2：5’ acctgctgttccattcttgtc -3；

通过PCR体系反应得到地高辛标记探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括WYSV阳性对照样品和阴性对照样品。