[发明专利]一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法在审
| 申请号： | 201810137112.X | 申请日： | 2018-02-10 |
| 公开（公告）号： | CN108424927A | 公开（公告）日： | 2018-08-21 |
| 发明（设计）人： | 张同存;顾潮江;潘丽娟 | 申请（专利权）人： | 武汉波睿达生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/66 |
| 代理公司： | 北京汇泽知识产权代理有限公司 11228 | 代理人： | 张涛 |
| 地址： | 430074 湖北省武汉市东湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 启动子 胞内区 质粒 细胞 细胞因子分泌 单链可变区 杀肿瘤细胞 抗原刺激 依次串联 持久性 铰链区 跨膜区 慢病毒 构建 敲除 体外 转导 串联 修复 表现 生产 | ||
1.一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，包括：依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD-1 shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19 CAR序列；所述三代CD19 CAR序列由CD19单链可变区、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区串联构成。
2.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为PD1-1 shRNA序列、PD1-4 shRNA序列、抗PD1-8 shRNA序列或抗PD1-10 shRNA序列。
3.如权利要求2所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-1 shRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求2所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-8 shRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述质粒结构以三代CD19 CAR序列的结构为信号传导结构域。
6.如权利要求5所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述三代CD19 CAR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.如权利要求5所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述三代CD19 CAR序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述H1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.一种权利要求1-8任一项所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过预实验优选出的合适的抗PD-1 shRNA序列，基因合成H1启动子；
2)之后将H1启动子和shRNA序列亚克隆合成到pLVX-EF1α-IRES-Puro标准载体的ClaⅠ和SphⅠ酶切位点之间，得到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体；
3)合成三代CD19-CAR序列，其两端带有BamHⅠ和MluⅠ的酶切位点，由酶切连接的方法亚克隆到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体，得到质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19。
10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述pLVX-EF1α-IRES-Puro载体上自带有EF1α启动子。
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