[发明专利]一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法

说明书

本发明涉及一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD‑1表达的质粒结构，包括依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD‑1shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19CAR序列；所述三代CD19CAR序列由CD19单链可变区、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人41BB胞内区、以及人CD3ζ胞内区串联构成。本发明所提供的质粒结构，将其用慢病毒转导进T细胞，比采用CRISPR/Cas9敲除PD‑1在生产CART细胞的工艺上简化了很大一步；并且这些CART细胞在体外受到抗原刺激后表现出了杀肿瘤细胞毒性的增强，细胞持久性的修复以及细胞因子分泌能力的上升。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法。

技术背景

美国食品和药物管理局(FDA)在2017年8月30日批准了第一个基因治疗，他们批准了Kymriah(tisagenlecleucel)治疗一些患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和年轻成人患者。Kymriah是一种基因改良的自体T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T细胞(CART)免疫疗法。最常见的CARs包括了一段抗原识别序列，比如一段单克隆抗体(mAb)的单链可变区片段(scFv)，以及主要来自于激活T细胞胞内信号域的TCRζ链(Lee DW,Barrett DM,MackallC,Orentas R,Grupp SA.The Future Is Now:Chimeric Antigen Receptors as NewTargeted Therapies for Childhood Cancer.Clin Cancer Res.2012；18(10):2780-2790.doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1920.)。靶向CD19的CART细胞已经在临床前和临床实验中表现出了十分有希望的结果，并且已经证明他们在具有难治性和复发性的b-前体急性淋巴细胞性白血病儿童和青少年中进行的有效抗白血病效应是安全可行的，所有的毒性可逆并且没有发生持续的B细胞发育不全(Lee DW,Kochenderfer JN,Stetler-StevensonM,et al.T cells expressing CD19chimeric antigen receptors for acutelymphoblastic leukaemia in children and young adults:A phase 1 dose-escalation trial.Lancet.2015；385(9967):517-528.doi:10.1016/S0140-6736(14)61403-3)。

然而，在治疗另一些血液肿瘤比如慢性淋巴细胞白血病和实体瘤方面还有很多的问题没有解决。肿瘤微环境在抑制和增强免疫应答方面具有十分重要的作用，为了能够消除肿瘤细胞，需要免疫系统的激活，效应细胞的扩增和激活效应细胞浸润到组织里面，才能消灭肿瘤细胞。而效应T细胞会被肿瘤微环境中的免疫检查点分子抑制，比如程序性死亡受体(PD-1).PD-1在急性髓细胞性白血病(AML)中与CART细胞的耗竭和机能障碍有关4,而PD-1的封闭能够在体外增强T细胞的生存和毒性，PD-1/PD-L1的结合反应可能是诱导活化导致的细胞死亡(AICD)产生的分子机制之一，并限制了CART细胞在体内的持续存在(GargettT,Yu W,Dotti G,et al.GD2-specific CAR T cells undergo potent activation anddeletion following antigen encounter but can be protected from activation-induced cell death by PD-1 blockade.Mol Ther.2016；24(6):1135-1149.doi:10.1038/mt.2016.63.)。