[发明专利]一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒

说明书

本发明涉及一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒，属于病原微生物体外分子检测技术领域。本发明提供了一种基于荧光PCR法同时检测三种隐球菌的引物探针组合，所述隐球菌包括新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质。本发明提供的引物探针组合能够实现新生隐球菌、格特隐球菌和罗伦特隐球菌的同时检测，检测特异型强，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及病原微生物体外分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测三种隐球菌的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

深部真菌病是指致病真菌不仅侵犯皮肤、黏膜而且侵犯深入部组织和内脏所致的疾病。真菌广泛分布于自然界，某些真菌可以感染人体而致病。深部真菌病常为继发感染，多在糖尿病、血液病、恶性肿瘤、大面积烧伤、严重营养不良或其他慢性消耗性疾病的基础上发病。或长期应用抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、使机体内菌群失调或抑制了机体的免疫反应而诱发。

隐球菌病是一种可能致命的真菌疾病，常使艾滋病患者罹患严重的脑膜炎或脑膜脑炎。其他易感者包括某些淋巴瘤患者(如霍奇金氏淋巴瘤)、结节病患者及长期使用糖皮质激素的患者。其中，新生隐球菌是最常见的病原，通常感染免疫功能低下者，而格特隐球菌越来越常被识别为具感染免疫功能正常者能力的病原体。

目前实验室对于隐球菌的诊断主要有以下三种：

(1)培养鉴定检测法

取自患处的标本作直接涂片或培养。隐球菌是实验室常见的污染菌，必须反复涂片或培养，多次阳性且为同一菌种才有诊断价值。虽然培养鉴定法是临床最常采用的方法，但是其培养周期较长。

(2)病理组织检查

取受损组织或淋巴结活检，可根据真菌形态确诊。尤其对播散性隐球菌，可及时作出诊断。病理组织检查的结果较为可靠，但是由于其具有创性，多数患者难以接受，限制了其应用。

(3)免疫方法

使用血清免疫学检测隐球菌细胞壁或代谢产物。该方法灵敏度不高、特异性不强，主要因为隐球菌感染早期局限在感染部位，未浸润入血，或仅微量入血因而抗原/抗体滴度很低。另一方面，真菌细胞壁蛋白为糖蛋白，其抗原性不强，抗体滴度普遍较低，且多糖包裹的蛋白隐藏在里面，抗体往往结合不上去，使得免疫活性降低。

(4)实时荧光聚合酶链反应法(Real-Time Fluorescence Polymerase ChainReaction，荧光PCR)

基于实时荧光聚合酶链反应法的检测技术经过二十多年的实践，不断改进并完善，逐渐成为临床分子诊断最成熟的核酸检测方法，它融汇了PCR技术的核酸高效扩增、基因扩增的灵敏性、分子杂交的特异性和光谱技术的敏感性及精确定量的特点，从根本上解决了PCR扩增产物的污染问题，尤其是荧光探针法(TaqMan法)，用一对引物加一条探针，决定了其特异性非常高，基本上不存在非特异性扩增，解决了交叉反应的难题。结果判定客观、真实。通过对微生物病原体的核酸检测，不仅可以协助判断是否有微生物病原体的感染，还可以对微生物病原体的流行进行调查和监控，帮助建立微生物病原体病的检测标准，为临床考评疗效提供依据，并能协助指导临床用药和预测疾病的发展等。然而，隐球菌由于种类繁多，种之间、种属之间(与其他属比如念珠菌属、曲霉属等)的核酸序列同源性较高，同时，整个真菌基因组发生变异的几率远大于人类基因组，使得可选择做为靶基因序列进行种属检测的基因序列不多，因此，对于设计特异性检测常见隐球菌比如新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌的荧光PCR的引物和探针的难度就比较大。

发明内容