[发明专利]检测猕猴桃溃疡病原菌的引物及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种高灵敏性检测猕猴桃溃疡病原菌Pseudomonas syringae pv.actinidae的一组特异性引物，其正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇‑AAAACCGCTGTGATACAATTCG‑3＇，如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇‑GATAGCCCTGAATGGTTTCCGAA‑3＇，如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了基于该特异性引物的检测方法和应用。

技术领域

本发明属于农业及植物检疫技术领域，具体涉及用于检测猕猴桃溃疡病原菌Pseudomonas syringae pv.actinidae的高灵敏度特异性引物及检测方法和应用。

背景技术

猕猴桃被称为水果之王和维生素C之冠，具有较高的经济效益，国内的主要种植区有四川、陕西和贵州等地。对于猕猴桃病害的检测、防控，是提高其经济价值，促进地区猕猴桃行业经济发展的必要手段。

溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的致命性细菌性病害，被列为全国森林植物检疫对象。丁香假单胞菌是猕猴桃病害的主要病原菌，目前认定主要病原菌之一是猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa)。该病原菌在6月中旬至9月底有很高的产孢能力，当猕猴桃幼果感染该菌时，会严重影响果实的生长，在6月感染时，容易发生采前落果。该病原菌对于果底部和果中部均有较强的侵染能力。

利用特异性引物检测病原菌仅通过PCR扩増结果便可以实现病原苗的鉴定，其具有简便快捷的优点，在病害早期诊断和及时防治领域中得到了广泛的应用。目前，对于猕猴桃溃疡病菌的PCR检测方面，现有技术也进行了一些有益尝试，如申请号为201610230023.0的中国专利提供了一种检测方法，避免了常规PCR方法出现的假阳性问题，并缩短了检测时间。

在实际检测工作中，除了对引物有特异性要求之外，还要求引物具有高度的敏感性。引物的特异性可以保证对具体病原菌检测的准确性，而敏感性可以更易于病原菌的精确检测，可在低含量下检出病原菌，更利于病害初期的诊断。然而，据发明人所知，在这方面的研究仍处于空白。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种高灵敏性检测猕猴桃溃疡病原菌Pseudomonas syringae pv.actinidae的一组特异性引物，所述一组特异性引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-AAAACCGCTGTGATACAATTCG-3＇，如SEQ IDNO.1所示，所述反向引物为：5＇-GATAGCCCTGAATGGTTTCCGAA-3＇，如SEQ ID NO.2所示；

所述一组特异性引物的检测灵敏度为1pg菌体DNA。

本发明的另一个目的在于提供一种猕猴桃溃疡病原菌Pseudomonas syringaepv.actinidae的高灵敏度检测方法，所述方法包括步骤：

(1)从待检测猕猴桃果品中提取DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为PCR模板DNA，进行PCR扩增；

(3)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得扩增产物，如产生目标大小条带，则证明猕猴桃果品感染溃疡病；

步骤(2)中，进行所述PCR扩增时，所用的引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-AAAACCGCTGTGATACAATTCG-3＇，如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇-GATAGCCCTGAATGGTTTCCGAA-3＇，如SEQ ID NO.2所示。

在实际检测工作中，步骤(3)中，所述条带的位置为730bp处。

一般情况下，步骤(1)中，可选的提取DNA的方法为CTAB法。

具体到本发明而言，所述CTAB法可以具体以下述步骤进行：