[发明专利]用于检测猕猴桃软腐病原菌的引物及检测方法和应用

权利要求书

1.一种高灵敏性检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的一组特异性引物，其特征在于，所述一组特异性引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-TCATTCGTGATCTCAAGCCAGA-3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇-TGCTGGTGAAGATAGACATCTGC-3＇，如SEQ ID NO.2所示；

所述一组特异性引物的检测灵敏度为1pg菌体DNA或者200CFU Botryosphaeriadothidea。

2.一种猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的高灵敏度检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)从猕猴桃果品中提取DNA；

(2)以步骤(1)所得DNA为PCR模板DNA，进行PCR扩增；

(3)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)所得扩增产物，如产生目标大小条带，则证明猕猴桃果品感染软腐病；

步骤(2)中，进行所述PCR扩增时，所用的引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-TCATTCGTGATCTCAAGCCAGA-3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇-TGCTGGTGAAGATAGACATCTGC-3＇，如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，提取DNA的方法为CTAB法。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CTAB法的步骤为：

1)取适量的猕猴桃果品放入1.5ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；

2)加入550μL 65℃预热的CTAB提取液，剧烈振荡后，放于65℃恒温箱中1h，其间间隔10min振荡混匀一次

3)加入550μL氯仿-异戊醇，剧烈震荡并充分混匀，静置10min，于13000r/min转速下离心5min；

4)取上清，加入600μL冰乙醇，于13000r/min转速下离心5min，倒掉上清，用75％乙醇冲洗沉淀；重复该步骤至少1次；

5)于7500r/min转速下空离心3min，用移液器吸去底部多余的液体，放于室温自然干燥；

6)干燥后，加入适量的灭菌ddH₂O充分溶解，然后保存于-20℃备用。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，进行所述PCR扩增时，所用的PCR反应体系包括10×PCR buffer、dNTP Mixture、模板DNA、Ex Taq、ddH₂O和所述引物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：PCR模板DNA：1.0μL、2.0mM的dNTP Mixture：2.0μL、10×PCR buffer：2.0μL、10mM的正向引物：0.5μL、10mM的反向引物：0.5μL、5units/μL的Ex Taq：0.1μL、加入ddH₂O至PCR反应体系体积为20μL。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：

1)于94℃进行模板DNA的预变性反应，反应时间为4min；

2)于94℃进行模板DNA的变性反应，反应时间为30s；

3)于60℃进行退火，时间为30s；

4)于72℃下进行延伸，时间为1min；

5)循环步骤1)～4)30次；

6)于72℃延伸5min；

7)对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳成像分析。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述特异性目标条带的位置为703bp处。

9.权利要求2～7任一项所述方法在检测由Botryosphaeria dothidea引起的猕猴桃软腐病上的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括对猕猴桃种苗检疫、土壤病原菌检测、猕猴桃软腐病早期病害诊断以及Botryosphaeria dothidea的检测和鉴定。