[发明专利]用于检测猕猴桃软腐病原菌的引物及检测方法和应用

说明书

本发明提供一种高灵敏性检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的一组特异性引物，其正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇‑TCATTCGTGATCTCAAGCCAGA‑3＇如SEQ ID No.1所示，所述反向引物为：5＇‑TGCTGGTGAAGATAGACATCTGC‑3＇，如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了基于该特异性引物的检测方法和应用。

技术领域

本发明属于农业及植物检疫技术领域，具体涉及用于检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的高灵敏度特异性引物及检测方法和应用。

背景技术

猕猴桃被称为水果之王和维生素C之冠，具有较高的经济效益，国内的主要种植区有四川、陕西和贵州等地。对于猕猴桃病害的检测、防控，是提高其经济价值，促进地区猕猴桃行业经济发展的必要手段。

软腐病是猕猴桃病害的主要病原菌之一。该病原菌在6月中旬至9月底有很高的产孢能力，当猕猴桃幼果感染该菌时，会严重影响果实的生长，在6月感染时，容易发生采前落果。该病原菌对于果底部和果中部均有较强的侵染能力。

利用特异性引物检测病原菌仅通过PCR扩増结果便可以实现病原苗的鉴定，其具有简便快捷的优点，在病害早期诊断和及时防治领域中得到了广泛的应用。具体在检测Botryosphaeria dothidea方面，“A PCR-based Technique for Identification ofFusicoccum sp.from Pistachio and Various Other Hosts in California ScientificSocieties”(DOI:10.1094/pdis.2002.86.5.515)基于ITS序列设计了能特异性扩增Botryosphaeria dothidea的引物对BDI/BDII，“A nested multiplex PCR for species-specific identification and detection of Botryosphaeriaceae species on mango”(DOI：https://doi.org/10.1007/s10658-012-0003-8)基于rDNA-ITS序列设计了一对扩增Botryosphaeria dothidea的特异性引物Bd318F/Bd318R。

不过，上述技术存在检测方法不简便或引物特异性低的问题。为此，中国专利ZL201310233134.3进行了改良，提出了一对特异性高的用于检测Botryosphaeriadothidea的引物BZY-1/BZY-2。

目前，对于Botryosphaeria dothidea的特异性引物的报道较少，且未成体系，所得的引物多为偶然获得。这种局面造成了Botryosphaeria dothidea的检测只能依赖零星几种引物，限制了对由该菌引起的猕猴桃软腐病的检测。

在实际检测工作中，除了对引物有特异性要求之外，还要求引物具有高度的敏感性。引物的特异性可以保证对具体病原菌检测的准确性，而敏感性可以更易于病原菌的精确检测，可在低含量下检出病原菌，更利于病害初期的诊断。

在获得较好特异性的基础上，提高检测灵敏性方面，现有技术在其它病害菌的检测方面进行了有益的尝试，如授权公告号为CN102816835B的中国专利，不仅实现了玉米内州萎蔫病菌的特异性检测，同时还实现了该病菌的微量检测，使得该方法可以准确快速的对进境玉米样品中Cmn的检测。

目前，虽然申请号为201310233134.3的中国专利实现了对Botryosphaeriadothidea的特异性检测，但在微量检测时的灵敏性还不尽人意。

因此，如何在获得对Botryosphaeria dothidea具有特异性且灵敏度高的引物，是现有技术所亟需的。

发明内容