[发明专利]急性肺损伤炎症消退动物模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种急性肺损伤炎症消退动物模型的构建方法，肺组织匀浆应用流式细胞术建立雾化吸入LPS急性肺损伤炎症消退模型。本发明的构建方法简便可行，能精确地模拟肺炎所致的急性肺损伤，精准鉴别急性肺损伤模型建立的成功与否，精确测得肺组织中巨噬细胞和中性粒细胞的变化，明确炎症发生和消退期炎症细胞的比例变化，精确定位炎症发生和消退期，为鉴别急性肺损伤炎症消退期提供了高效手段，应用范围广。

技术领域

本发明涉及动物实验模型，特别涉及应用流式细胞术建立雾化吸入LPS急性肺损伤炎症消退模型。

背景技术

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征是临床最常见的急危重症，为肺部感染、创伤最主要的死亡原因。全球每年新发病例600多万，重症患者病死率高达50％以上。其病理特征主要为大量炎症细胞浸润导致过度炎症反应，即炎症不能及时消退。

目前多用细胞进行流式细胞分析，比如检测细胞凋亡、增殖、细胞表达分子等。然后利用细胞做流式分析的话，存在多种问题：

组织原代细胞分离方法复杂，纯度不高，分离原代细胞多种步骤操作，严重影响细胞状态，因此很难精确地模拟肺炎所致的急性肺损伤，精准鉴别急性肺损伤模型建立的成功与否，明确炎症发生和消退期炎症细胞的比例变化。

发明内容

本发明针对上述问题，提出了一种急性肺损伤炎症消退动物模型的构建方法，采用肺组织匀浆，采用流式细胞术肺组织炎症各种细胞进行计数分析，以实现精确地模拟肺炎所致的急性肺损伤，精准鉴别急性肺损伤模型建立的成功与否，明确炎症发生和消退期炎症细胞的比例变化的目的。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明提供一种急性肺损伤炎症消退动物模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤a，雾化吸入脂多糖，建立动物模型；

步骤b，取动物模型的肺组织；

步骤c，将肺组织酶解后制成肺组织匀浆，采用流式细胞术肺组织炎症各种细胞进行计数分析。

进一步，所述动物为小鼠。

进一步，步骤a中，脂多糖的雾化浓度为500μg/ml。

进一步，步骤b，取动物模型肺组织时，腹主动脉充分放血，心脏充分抽血。

进一步，步骤c中，肺组织加入胰酶以及DNA酶，剪碎，消化后加入含有FBS的培养基来终止胰酶的消化；震荡后过滤，然后重悬2次，计数，调至设定浓度；抗体染色，冰上避光孵育；取出后洗涤、离心，弃上清，.重悬后流式细胞仪检测细胞数。

进一步，步骤c中，剪碎肺组织成小块，每块体积1-3mm³。

进一步，步骤c中，消化15min。

进一步，步骤c中震荡后300目滤网过滤。

进一步，步骤c中，设定浓度为1.5*10⁶个/ml。

进一步，冰上避光孵育30min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的急性肺损伤炎症消退动物模型的构建方法采用肺组织匀浆进行流式细胞术建立雾化吸入LPS急性肺损伤炎症消退模型。本发明采用肺组织匀浆而非细胞进行流式细胞分析具有以下优势：

1、肺组织匀浆细胞全面囊括了组织中所有类型细胞，细胞分离由于受操作，技术熟练程度，手法的不同而分离纯度不同，影响目的细胞的最终百分比。

2、肺组织匀浆步骤相对细胞分离步骤简单，耗时短，成本低，可重复性高。