[发明专利]一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法

说明书

本发明公开了一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法，该方法包括以下步骤：取刚好完全展开的桉树成熟叶片，消毒，损伤其表层表皮细胞，并取样得到叶盘；得到的叶盘置于外源基因重组农杆菌菌液中浸泡，抽真空；取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满MS液体培养基的无菌载体上，暗处放置培养至待农杆菌完成转化。取出农杆菌侵染后的叶盘置于吸满培养液的无菌滤纸上，暗处放置培养待农杆菌完成转化。通过本发明的叶盘瞬时表达法可快速检测启动子在桉树叶组织的转录活性，为启动子的改良和转录活性的快速检测提供了方法；还可初步确定目的基因表达变化及对其他基因表达和信号转导途径的影响，加快桉树的基因互作和信号转导的研究进程，避开桉树转化困难和难获得转基因苗的窘况。

技术领域

本发明涉及基因的瞬时表达技术领域，更具体地，涉及一种外源基因转入桉树进行瞬时表达的方法。

背景技术

桉树原产澳大利亚，是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)植物的统称，有900多个种、亚种和变种。由于桉树具有耐干旱、耐瘦瘠、适应性广、生长速度快、轮伐期短、用途广泛、经济效益高等诸多优点，被公认为三大人工林树种之一(杨民胜等，2011)。桉树是我国南方主要造林树种之一，全国桉树人工林面积已达368万hm²，且每年新营造桉树林达10万hm²(谢耀坚，2011)。近年来，在国家政策的大力支持下，南方以桉树为主的速生丰产林得到了快速发展，全国桉树人工林面积达450万hm²，丰富了我国的森林资源，缓解了木材供需矛盾，壮大了林业经济，桉树产业链年产值超3000亿元。

罗基同等(2012) 调查了速生丰产桉树病害，鉴定出30种传染性病害，其中15种为主要病害，严重的有枯梢病、树干溃疡病、轮纹叶斑病、花斑病、焦枯病、紫斑病、灰霉病和青枯病等8种真菌病害或细菌性病害。为了促进桉树产业的可持续发展，桉树生产必需解决好提高木材蓄积量、改良材质、增强病虫害抗性等诸多问题。

由于桉树生长周期长，杂合度高，许多性状属于多基因控制的数量性状，人工杂交授粉难以控制，常规育种难度大、效率低，难以满足培育优良种质的要求。与传统育种方法相比，转基因技术可以打破传统育种中种间不亲和现象，消除杂交障碍，极大地拓宽优良基因的来源和应用，具有投入少、见效快等优点（Klocko等, 2016）。通过转基因育种加速桉树的遗传改良，提高桉树生产力、木材质量和抗性，扩展桉树的种植范围，能为纤维材料、木材、能源等提供优质原材料，促进经济、生态、社会和环境的和谐发展。

植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。并且具有如下优点：①简单快速。转化基因可在转化的一周内进行分析，避免了组织培养等繁杂过程；②表达水平高。当单链的T-DNA进入植物细胞后，许多未整合到植物基因组中的游离外源基因同样可以表达。③安全有效。不受植物生长发育过程的影响，不产生可遗传的后代，结果可靠直观，不存在基因漂移的风险。

另外，植物基因工程必须解决好怎样控制目的基因表达和控制什么基因表达的问题。怎样控制目的基因表达实质上是指如何选用启动子。启动子实质上是RNA聚合酶特异性识别后并结合的一段DNA序列，是调控基因转录的关键因子，也是构建基因工程表达载体的重要元件。启动子有组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子等。

启动子在不同物种中的转录活性不一定相同，在其他作物中理想的启动子在桉树中转录活性如何需要检验。但桉树为木本植物，细胞中酚类物质含量高、组织培养时外植体极易褐变致死（Huang等，2010）。尤其是转化后的愈伤组织比单纯的再生过程中愈伤组织更易褐变致死，或者愈伤分化时容易出现嵌合体，造成桉树转化率低，遗传改良难度大。