[发明专利]一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高产两性霉素的重组结节链霉菌及其应用，所述重组结节链霉菌是将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.5所示的透明颤菌血红蛋白(Vhb)、S‑腺苷甲硫氨酸合成酶(Metk)、两性霉素合成基因簇调控因子(AmphRIV)、次级代谢产物全局调控因子(AraC)以及红霉素强启动子ermE*p序列导入结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050获得。通过导入并过表达上述基因，使重组结节链霉菌中，两性霉素B产量提高约45％，副产物两性霉素A产量降低60％，并缩短在发酵过程中菌体生长周期，达到提升生产效率的目的。

技术领域

本发明涉及一种通过基因工程手段提高两性霉素B，降低两性霉素A，缩短菌株发酵周期的方法，特别涉及一种高产两性霉素B的重组结节链霉菌及其应用。

背景技术

两性霉素B(Amphotericin B，AmB)属于多烯大环内酯类抗生素，具有抗真菌活性。上个世纪中叶，从奥里诺科河三角洲的土样中分离并鉴定出产生菌，结节链霉菌(Streptomyces nodosus)。近期研究发现，真菌Penicillium nalgiovense也可产生AmB，但产量极低并未实际用于生产。AmB作为七烯大环内酯类抗生素其结构有如下特点：具有7个共轭多稀的大环内酯，C8位羟基、C16位羧基以及C19的海藻糖胺基团。AmB主要用于治疗真菌感染，通过与敏感真菌细胞膜上的甾醇相结合，改变细胞膜的通透性，引起细胞内重要物质渗漏，而使真菌细胞死亡。AmB特别适用于具有生命威胁的全身性真菌感染，如毛霉病、孢子丝菌病和曲霉病等。近期研究发现AmB还有抗病毒、抗寄生虫的能力，如抗朊病毒和美洲利什曼原虫病等。

AmB分子式为C₄₇H₇₃NO₁₇，熔点170℃，旋光度+420，在405、382、362、345、283、273、263、225nm紫外波长下具有吸收峰。AmB为黄色或橙黄色粉末，有引湿性，几乎无臭无味，在光照下宜破坏其结构而导致活性丧失。不溶于水、无水乙醇，在二甲基亚砜(DMSO)中溶解，在二甲基甲酰胺(DMF)中微溶，在甲醇中极微溶解，其溶解度(pH 6-7)均低于1mg/L。结节链霉菌能够同时产生两性霉素A(AmA)和AmB两种成分，AmA的抗菌活力低未在临床应用，两者结构式如图1。

两性霉素作为链霉菌代谢途径中的次级代谢产物，在生长发酵的过程中涉及到大量基因的转录调控，很多内源基因和外源基因对菌体生长和次级代谢产物产量起到重要影响。内源基因中，合成基因簇的AmphH、AmphG是两性霉素合成基因簇的ABC转运蛋白，能够结合与水解ATP，利用ATP的能量跨膜转运各类生物分子，例如糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢物等等；合成基因簇的AmphRIV是两性霉素合成基因簇的转录调控因子，能够对相应的合成基因簇产生调控作用，同时还可以影响氨基酸代谢、核酸辅酶代谢、DNA复制重组修复、呼吸和能量代谢、碳水化合物代谢等；AraC是链霉菌全局调控因子，属于AraC/XylS家族的转录调控蛋白，以转录激活因子的形式参与到碳代谢、形态分化和次级代谢等各类调控过程。