[发明专利]多功能靶向性基因载体及制备方法及用途

说明书

本发明公开了一种多功能靶向性基因载体及制备方法及用途，多功能靶向性基因载体，是用P(LA‑co‑GA)‑PEI‑PEG‑NLS‑G‑TAT‑G‑REDV所示的聚合物；本发明的多功能靶向性基因载体，具备穿膜功能和核定位功能、对内皮细胞的靶向功能，通过REDV肽与内皮细胞表面的整合素受体的特异性识别，以及TAT的穿膜作用，提高多功能靶向性多肽修饰的基因载体制备的基因复合物的细胞摄取。通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进基因的核内在化，从而提高基因递送效果，实现提高转染效率和促进细胞迁移增殖的目的。以解决目前非病毒载体面临的问题。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及到多功能靶向性基因载体及制备方法及用途。

背景技术

基因治疗是很有前景的治疗先天和后天心血管疾病的方法。它是通过载体将治疗性基因有效地传递到靶细胞内，通过基因的表达，调节细胞的行为，从而达到治疗的目的。基因疗法对于治疗心血管疾病的核心问题在于如何提高治疗性基因在内皮细胞的表达效率，而基因载体则在基因传递系统中起着重要的作用。为促进基因复合物在内皮细胞中的传递，增强目的基因的表达，研究表明，Arg-Glu-Asp-Val(REDV)是纤维粘连蛋白衍生的四肽，能特异性的被内皮细胞表面的α4β1整合素识别。而此类整合素在内皮细胞表面表达丰富，但在平滑肌细胞上几乎没有表达。因此，REDV多肽经常用于修饰人工血管表面，实现对内皮细胞的特异性识别和粘附。但是基因复合物实现基因在细胞内的表达需要经历复杂的胞内运输途径，例如在内涵体逃逸和核内在化等方面会存在一定的障碍。

聚阳离子基因载体，例如聚乙烯亚胺(PEI)，含有大量氨基，正电荷较多，进入细胞后可以通过质子海绵效应促进载体实现内涵体逃逸的能力，提高转染效率。然而，较高的电荷密度使得其毒性较高。与阳离子聚合物基因载体相比，多肽载体具有低毒性和高生物相容性。穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPP)是近年来发现的一类具有高效细胞膜穿透能力而且不损伤细胞膜结构和功能的多肽。多数研究己经证明穿膜肽不仅自身能透过多种细胞膜，而且还可有效携带亲水性蛋白、多肽、基因、药物等外源物质，快速穿过细胞膜进入胞质或胞浆，而细胞膜却完好无损，对细胞没有显著毒副作用。YGRKKRRQRRR(TAT)是最常用的细胞穿膜肽，含有丰富的精氨酸片段可以促进细胞内在化。但是，TAT在不同细胞中的细胞摄取不存在特异性。

细胞核是细胞的控制中心，包含蛋白质合成所需的基因信息。细胞核膜只允许粒径小于10纳米的颗粒在细胞核与细胞质之间自由穿行，而较大的颗粒需要经由核膜上核孔的核定位信号(NLS)来传送，因此，可利用NLS提高核酸向核内运送的能力。

目前，尚未有利用多功能靶向多肽(REDV-G-TAT-G-NLS)修饰聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺及用途的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种对内皮细胞具有靶向识别能力，高转染效率且低毒的多功能靶向性基因载体。

本发明的第二个目的是提供多功能靶向性基因载体的制备方法。

本发明的第三个目的是提供多功能靶向性基因载体的用途。

本发明的技术方案概述如下：

多功能靶向性基因载体，是用P(LA-co-GA)-PEI-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV所示的聚合物；

其中，P(LA-co-GA)-PEI为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称；

PEG为聚乙二醇的简称；

REDV-G-TAT-G-NLS为多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。

上述多功能靶向性基因载体的制备方法，包括如下步骤：