[发明专利]一种采用Taqman探针定量检测结核分枝杆菌复合体的试剂盒

说明书

本发明涉及一种采用Taqman探针定量检测结核分枝杆菌复合体的试剂盒。试剂盒包括MTBC和BG的引物和探针混合液、含MTBC基因组的DNA质粒、含β‑球蛋白的DNA质粒、含β‑球蛋白的DNA质粒、酶混合液。本试剂盒是诊断结核杆菌复合体感染的装备，适用于预防结核病，体外检测结核分支杆菌复合体(MTBC)，可作为诊断结核病人群的辅助检测方法，用于感染结核杆菌复合体病人药物治疗的疗效监控。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种用Taqman探针定量检测结核分枝杆菌复合体的试剂盒。

背景技术

结核病是一种全球常见的慢性消耗性疾病，该病具有长期性、周期性、反复性等特点，严重危害人类健康，特别是随着艾滋病全世界范围内的传播与流行，结核病近年来在各国的发病率和死亡率都呈上升趋势，目前已经成为世界最严峻的公共卫生问题之一。目前位于世界传染病首位，我国位于第二位，国内三分之一人口已感染了结核杆菌，并面临发展为活动性肺结核的危险。结核病给国家和社会带来了沉重的负担，严重制约我国经济和社会的发展。根据《全国各省法定传染病疫情动态摘抄(200602期)》统计数据，全国31个省(自治区、直辖市)通过疾病监测信息报告管理系统报告的肺结核数据资料，2月报告的肺结核病例总数为103 823例，与上年同月比上升了45.16％，与去年同月比上升了16.20％。有关研究显示，我国传染病人发现率仅为45％，2004年“中国结核病控制项目——社会评价研究报告”表明，诊断延迟正是我国结核病防治工作进度缓慢的最重要的原因之一。大多数结核病患者往往因为没有早期诊断和早期治疗而失去最佳的治疗时机，同时严重影响了结核病人的发现、诊断和控制。

随着基因诊断技术的不断发展，国内外许多研究人员将基因技术引入到结核分枝杆菌的诊断体系中来。聚合酶链式反应技术(PCR)自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用。近年来出现的核酸定量PCR技术尤其是实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研究中的重要工具。中山大学达安基因股份有限公司的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)(国食药监械(准)字2011第3400392)，上海之江生物科技有限公司的结核杆菌(TB)核酸测定试剂盒(荧光PCR法)(国食药监械(准)字2011第3400128号)和深圳匹基生物工程有限公司的结核分枝杆菌(TB)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(国食药监械(准)字2009第3400575号)等，以上快速诊断试剂的研制对结核的监测和临床诊断提供了有效可靠的检测手段。

本发明采用实时荧光定量PCR产物的检测技术，采用TaqMan探针法代替传统的双链DNA嵌合荧光染料技术，操作简单，该试剂盒可直接探测PCR过程中的荧光变化，获得DNA模板的准确定量结果，有效地弥补了现有检测结核分枝杆菌方法存在的检测周期长、操作易污染、阳性符合率低等问题。为结核病的快速诊断、疗效评价以及结核病流行病学调查等提供更加准确、敏感、特异和快速的检测方法。

发明内容

本发明涉及一种用Taqman探针定量检测结核分枝杆菌复合体的试剂盒。可用于检测人结核杆菌、牛结核杆菌、田鼠结核杆菌、非洲分枝杆菌和canettii分枝杆菌。

本发明采用双通道实时荧光定量PCR检测方法，基于标记引物和荧光探针通过扩增子的监控，能在一次反应在30-50循环中对结核分枝杆菌复合体DNA进行定性定量。

本发明提供的上述试剂盒的定性分析如下：

具体实施方式

实施例1：DNA提取

(1)向玻璃管中加入1.5ml灭菌生理盐水，充分震荡混匀，挤干棉拭子；