[发明专利]一种高转化率运动发酵单胞菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)结合参考文献及数据库KEGG，预测运动发酵单胞菌ZM4和ZM401全基因组限制-修饰系统(R-M system)相关基因；

2)对预测到的两个所述限制-修饰系统相关基因分别设计敲除引物；

3)分别以ZM4和ZM401为出发菌株，敲除掉所述限制-修饰系统相关基因，得到所述菌株ZM4△1933、ZM4△0028、ZM401△1933、ZM401△0028；

4)以ZM4△0028为所述出发菌株，再敲除ZMO1933基因，得到ZM4△0028△1933双敲除菌株，即ZM4m；以ZM401△1933为所述出发菌株，再敲除ZMO0028基因，得到ZM401△0028△1933双敲除菌株，即ZM401m。

2.如权利要求1所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，步骤3)中通过自杀质粒敲除所述限制-修饰系统相关基因。

3.如权利要求2所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，所述的自杀质粒为质粒pEX18Tc。

4.如权利要求1所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，敲除所述出发菌株的所述限制-修饰系统相关基因，最终修成无抗性标记残留的高转化效率的所述菌株。

5.如权利要求1所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，所述的限制-修饰系统相关基因包括：Ⅰ型限制-修饰系统相关基因ZMO1933和Ⅳ型限制-修饰系统相关基因ZMO0028。

6.如权利要求1所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，所述出发菌株包括ZM4和ZM401，美国菌种保藏中心编号分别为：ATCC31821和ATCC31822。

7.如权利要求5所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，所述Ⅰ型限制-修饰系统相关基因ZMO1933的敲除引物包括两对所述Ⅰ型限制-修饰系统相关基因ZMO1933的上游同源臂和下游同源臂的引物，所述上游同源臂的一对引物序列如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示，所述下游同源臂的一对引物序列如SEQ ID No.7及SEQID No.8所示，克隆出了这两个同源臂后，通过同源重组来进行基因敲除。

8.如权利要求5所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，所述Ⅳ型限制-修饰系统相关基因ZMO0028的敲除引物包括两对所述Ⅳ型限制-修饰系统相关基因ZMO0028的上游同源臂和下游同源臂的引物，所述上游同源臂的一对引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示，所述下游同源臂的一对引物序列如SEQ ID No.3及SEQID No.4所示，克隆出了这两个同源臂后，通过同源重组来进行基因敲除。

9.如权利要求1所述的一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，所述的敲除包括以下步骤：

(a)PCR扩增所述限制-修饰系统相关基因上下游同源臂，通过overlap PCR方法获得大片段；

(b)连接所述大片段与所述自杀质粒得到重组质粒，将重组质粒去甲基化后，采用电转化法将所述质粒转化到运动发酵单胞菌ZM4和ZM401中；

(c)单交换转化子及双交换转化子的验证、筛选、鉴定，即得到1个限制-修饰系统相关基因敲除的所述菌株；

(d)以所述Ⅰ型限制-修饰系统相关基因ZMO1933敲除的所述菌株为受体菌，重复步骤(a)到(c)，进行所述Ⅳ型限制-修饰系统相关基因ZMO0028的敲除，即可获得2个所述限制-修饰系统相关基因敲除的所述菌株；或以所述Ⅳ型限制-修饰系统相关基因ZMO0028敲除的所述菌株为受体菌，重复步骤(a)到(c)，进行所述Ⅰ型限制-修饰系统相关基因ZMO1933的敲除，即可获得2个所述限制-修饰系统相关基因敲除的所述菌株。

10.一种权利要求1所述的具有高转化效率的运动发酵单胞菌的应用，所述应用为作为基因工程菌在基因组大片段删除方面的应用。