[发明专利]一种高转化率运动发酵单胞菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高转化率运动发酵单胞菌的构建方法；同时本发明还涉及一种高转化率运动发酵单胞菌；第三方面本发明还涉及一种高转化率运动发酵单胞菌在基因工程领域的应用。构建方法包括：结合参考文献及数据库对运动发酵单胞菌Zymononas mobilis ZM4全基因组限制‑修饰系统相关基因进行预测；对预测到的两个和限制修饰系统相关的基因分别设计基因敲除引物，以ZM4和ZM401为出发菌株，通过质粒pEX18Tc敲除掉相关基因，最终得到的ZM4m和ZM401m为限制‑修饰系统相关基因敲除菌株。本发明所得菌株的转化效率明显提高，获得的转化子数目多，阳性率高，在生长性能和发酵性能方面和野生型菌株无异。以双敲除菌株作为出发菌株更有利于运动发酵单胞菌的分子改造及相关的机理研究。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高转化率运动发酵单胞菌及其构建方法和应用。

背景技术

运动发酵单胞菌(Zymononas mobilis)是一种革兰氏阴性兼性厌氧细菌。由于其具有独特的ED代谢途径和高效的乙醇发酵性能，该菌株在生物炼制领域被认为具有广阔的应用前景。除了具有上述优点，运动发酵单胞菌还存在着一些缺陷诸如：底物利用范围狭窄，只能利用葡萄糖、果糖和蔗糖；对抑制物的耐受性差；代谢图谱过于简单，产物种类少。为了拓展运动发酵单胞菌在工业上的应用，利用基因工程技术对其进行改造是一种较好的方式，也是目前生物技术领域研究的焦点。

由于目前对运动发酵单胞菌的基因工程改造一般涉及到目标基因的过表达和敲除等操作，但是运动发酵单胞菌基因操作体系存在转化效率较低、可用抗性筛选标记少、大质粒操作困难等特点，其基因工程改造大受限制，甚至在一些情况下，外源基因无法导入其中。运动发酵单胞菌自身已经存在着很多抗性基因，而传统的针对于运动发酵单胞菌的基因敲除手段通常会引入一些抗生素抗性标记用于转化子的筛选，这为实现多基因操作带来了不便。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种高转化率运动发酵单胞菌ZM4m和ZM401m及其构建方法和应用。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是运动发酵单胞菌基因改造操作体系存在效率较低、大质粒操作困难、基因工程改造大受限制，甚至在一些情况下，外源基因无法导入其中。

研究表明运动发酵单胞菌种限制修饰系统(Restriction-Modification system)的存在是导致其基因操作困难的重要原因。在运动发酵单胞菌中存在着Ⅰ,Ⅰ,Ⅰ和OphanM类型的限制-修饰系统，其中编码Ⅰ型限制-修饰系统主要成分的基因ZMO1933和编码Ⅳ型限制修饰系统的基因ZMO0028的敲除对于提高运动发酵单胞菌质粒的转化效率具有最优良的结果。同时，敲除限制修饰系统以提高其他菌株的转化效率在文献和专利中都有所记载。

利用自杀质粒pEX18Tc实现对运动发酵单胞菌的Ⅰ型和Ⅳ型限制修饰系统的双敲除，自杀质粒pEX18Tc在运动发酵单胞菌基因组上经过同源重组双交换后便可实现对于目标基因的敲除，而且不会残留任何的抗生素抗性痕迹，这为实现多基因敲除奠定了理论基础。为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种具有高转化效率的运动发酵单胞菌菌株的构建方法。

在一个优选的实施例中，该构建方法的步骤如下：

1)结合参考文献及数据库KEGG，预测运动发酵单胞菌ZM4和ZM401全基因组限制-修饰系统(R-M system)相关基因。

2)对预测到的两个和限制-修饰系统相关的基因分别设计基因敲除引物。

3)分别以ZM4和ZM401为出发菌株，敲除相关基因，得到菌株ZM4△1933、ZM4△0028、ZM401△1933、ZM401△0028。