[发明专利]间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：包括：

获取间充质干细胞原代细胞；

间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及

间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述第一消化液为0.25％胰蛋白酶-EDTA。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述的进行离心分离为在800～1200转/分下离心6～10min。

4.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。

5.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：

抽取骨髓液并稀释：用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液，混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液；

细胞的分离与纯化：将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上，通过离心分离纯化单个核细胞群，然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀；及

细胞扩增培养：将离心分离后得到的沉淀利用无血清培养液混悬，按5×10⁶/mL的密度进行接种并于35～40℃、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到骨髓间充质干细胞原代细胞。

6.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为自体脂肪间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：

抽取自体脂肪颗粒并剪碎：抽取自体脂肪颗粒，剔除可见微血管及肌肉组织，用PBS进行洗涤，然后将脂肪组织剪碎至糊状使其小于1mm³；

细胞的分离与纯化：往糊状的脂肪组织中添加第二消化液进行消化，消化后过滤收集滤液，然后使用含有10％FBS的低糖DMEM培养基进行中和，再离心得到沉淀；及

细胞扩增培养：往经过细胞的分离与纯化后得到的沉淀中加入无血清培养基，以1×10⁶/mL的密度进行接种，并于35～40℃、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到自体脂肪间充质干细胞原代细胞。

7.如权利要求6所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述第二消化液为含有0.1％胶原酶I型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM。

8.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：

处理脐带：取脐带并剪断，剪断后的脐带总长度大于15cm，用生理盐水清洗后，再用含2倍双抗生理盐水去除血渍，接着去除血管与外膜，剥离华尔通胶并剪成0.5～1mm³；及

细胞扩增培养：将剪碎的华尔通胶涂布于培养皿上，加入无血清完全培养基，于35～40℃、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养，培养7～10天即可得到脐带间充质干细胞原代细胞。