[发明专利]间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，提供一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法。一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：获取间充质干细胞原代细胞；间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞的分离。该间充质干细胞的分离培养方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞。并且针对上述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间质干细胞，本发明还提供一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，能很好的保存并复苏该间质干细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法。

背景技术

干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后(或植入)人体，用于疾病治疗的过程。这种体外操作包括干细胞的分离、纯化、扩增、冻存和冻存后的复苏等过程。目前国内外已经开展了多种干细胞类型的临床应用研究，涉及的主要疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GVHD)、脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。其中由于间充质干细胞(MSCs)具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力等，广泛应用于临床各种疾病的治疗。

开展临床试验治疗，需要制备大量的细胞，而用于干细胞治疗的细胞制备技术具有多样性、复杂性和特殊性。作为一种新型的生物治疗产品，干细胞制剂除了像其他细胞制品一样遵循一个共同的研发过程，即从细胞制剂的制备、体外实验、体内动物实验，到植入人体的临床研究即临床治疗的过程外，还具备其特殊性。这种特殊性就是干细胞是最原始的细胞，任何细微的微环境改变都会影响其功能的发挥。而在干细胞制备过程中，从体内干细胞分离出来后，干细胞的性质就开始发生变化，因此如何操作以确保干细胞具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应等，是一个亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞，并且能很好的保存并复苏该间质干细胞。

为解决上述技术问题，发明采用如下所述的技术方案。一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：

获取间充质干细胞原代细胞；

间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及

间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。

优选地，所述第一消化液为0.25％胰蛋白酶-EDTA。

优选地，所述的进行离心分离为在800～1200转/分下离心6～10min。

优选地，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。

优选地，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：

抽取骨髓液并稀释：用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液，混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液；

细胞的分离与纯化：将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上，通过离心分离纯化单个核细胞群，然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀；及