[发明专利]一种用酶法制备UDP的方法

权利要求书

1.一种用酶法制备UDP的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将尿苷、糖类碳源、大肠杆菌产生重组表达的尿苷二磷酸酶、无机离子与酵母混合保温发酵，发酵终止后得尿苷二磷酸发酵液；

2)将所述的尿苷二磷酸发酵液进行冰块降温预处理，并通过微滤装置分离出澄清的微滤液；

3)将所述的微滤液进行离子交换，采用不同浓度NaCl溶液进行淋洗、洗脱；

4)将所述洗脱后的收集液进行纳滤除盐；

5)将所述纳滤除盐后的收集液用强碱型阴离子交换柱树脂进行脱色；

6)将脱色后的尿苷二磷酸进行醇沉结晶、干燥。

2.如权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述的无机离子包括阳离子和阴离子；所述的阳离子选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离子是磷酸根离子；所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖。

3.如权利要求2所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述的无机离子由磷酸二氢钾、硫酸镁产生；所述的磷酸二氢钾的终浓度为50±10g/L；所述的硫酸镁的终浓度是3.5±0.5g/L。

4.如权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述的碳源是葡萄糖；所述的葡萄糖的终浓度是35±10g/L；所述的尿苷终浓度是25±10g/L；所述的酵母的终浓度是240±50g/L。

5.如权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述大肠杆菌产生重组表达的尿苷二磷酸酶，其方法包括：

(1)提供重组表达载体，包括尿苷二磷酸酶编码基因galU；

(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；

(3)培养(2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸酶。

6.如权利要求5所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，在重组表达尿苷二磷酸酶时，当菌株在培养基中OD600达到0.5时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mM，诱导后继续培养3.5小时，收集菌体，破碎，分离上清。

7.根据权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于所述混合发酵的发酵温度为35～40℃，pH值为6.6～7.0，发酵时间为2～5小时；当可以终止发酵时，温度降至10～20℃使发酵终止，所用终止反应剂为冰块。

8.根据权利要求l所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于所述的预处理采用微滤处理，所用微滤膜的孔径为0.05～5.0μm。

9.根据权利要求l所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于在纳滤除盐时，过滤采用截留分子量为400～500道尔顿的纳滤设备。

10.根据权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于所述醇沉结晶时，用80～95％乙醇沉淀，并调pH值为3.7～3.9，温度为20～30℃，最终酒精浓度达到60～65％，醇沉时间为6～8h。